Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines du macrophage et de la biologie cellulaire dendritique sur la localisation subcellulaire et la dynamique de diverses protéines dans ces types de cellules. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle est relativement simple, peu coûteuse et démontre une meilleure efficacité et stabilité d’expression que la majorité des autres méthodes disponibles. Jarmila Kralova, une étudiante diplômée de mon laboratoire, démontrera la procédure.
Pour produire le rétrovirus, plaquez une suspension à cellule unique des cellules platinum eco-emballage dans une boîte de Pétri de 10 centimètres et cultivez les cellules en 15 millilitres de DMEM, complétées par 10% sérum bovin fœtal, ou FBS, jusqu’à ce que la culture soit 50 à 60% confluent. Le lendemain, ajoutez 20 microgrammes de la construction rétrovirale d’intérêt et 10 microgrammes de vecteur d’éco-emballage PCL à 1 millilitre de DMEM sans sérum, avec mélange doux. Ajouter 75 microlitres de l’Île-du-Prince-Édouard dans 1 millilitre de DMEM sans sérum et antibiotiques à un deuxième tube pour une incubation de cinq minutes à température ambiante, et mélanger le contenu des deux tubes ensemble pour une incubation supplémentaire de 10 minutes à température ambiante.
Ensuite, remplacez soigneusement le milieu sur les cellules Platinum Eco par 8 millilitres de DMEM frais de 37 degrés Celsius complétés par 2%FBS et ajoutez soigneusement le mélange de transfection en gouttes à l’assiette. Après une incubation de 4 heures à 37 degrés Celsius, remplacer le supernatent par 10 millilitres de 37 degrés Celsius DMEM, complétée par 10%FBS pour une incubation de 24 heures à 37 degrés Celsius. Le lendemain, utilisez une pipette de 5 millilitres pour transférer le supernatent rétroviral écotropique contenant des particules dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres et enlever les débris et les cellules contenant par centrifugation.
Pendant ce temps, ajouter 10 millilitres de 37 degrés Celsius DMEM plus 10%FBS au plat de culture pour une autre incubation de 24 heures à 37 degrés Celsius et de recueillir une deuxième série de particules virales comme vient de le démontrer. Pour récolter la moelle osseuse, dans une hotte de culture tissulaire, utilisez des pinces à épiler et des ciseaux pour enlever la peau et une partie des muscles des membres postérieurs et déloger soigneusement l’acétabulum de l’articulation de la hanche sans casser le fémur. Couper les pattes aux articulations de la cheville et pulvériser les os avec 70% d’éthanol.
Ensuite, retirez le reste du muscle avec une serviette en papier et placez les os dans une boîte de Pétri de 5 centimètres de PBS complétée par 2%FBS. Ensuite, pliez l’articulation du genou de chaque os et séparez soigneusement les os avec des ciseaux. Utilisez les ciseaux pour enlever environ un à deux millimètres de chaque épiphyse d’un os et utilisez une seringue de deux ou cinq millilitres munie d’une aiguille de calibre 30 chargée de PBS frais plus FBS pour rincer la moelle osseuse des deux extrémités de l’os dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres.
Lorsque la moelle a été prélevée dans chacun des os, pelleter les cellules osseuses par centrifugation et suspendre à nouveau la pastille dans 2,5 millilitres de tampon de lyse des globules rouges pendant deux à trois minutes à température ambiante. Après lysing, filtrer les cellules à travers une passoire à cellules de 100 micromètres dans un nouveau tube centrifugeuse de 15 millilitres et restaurer la ténacité avec 12 millilitres de PBS plus FBS. Re-suspendre la pastille dans DMEM, complétée par 10%FBS et antibiotiques pour le comptage et plaque cinq à 10 fois 10 à la sixième cellule de moelle osseuse dans un 10 centimètres, la culture non tissulaire traité boîte de Pétri en 10 millilitres de DMEM complété par le sérum et macrophage colonie facteur stimulant, ou MCSF.
Le cinquième jour de la culture, inclinez soigneusement le plat de culture cellulaire et retirez tous les millilitres de milieu sauf environ de la surface près du bord du plat. Ajouter ensuite 20 millilitres de milieu frais de 37 degrés Celsius complétés par fbs et MCSF au plat et retourner les cellules à l’incubateur de culture cellulaire. Pour récolter les cellules, le sixième au septième jour, enlever toutes les cellules moyennes et flottantes et laver la culture avec 37 degrés Celsius PBS.
Détachez les cellules adhérentes avec cinq millilitres de 0,02%EDTA et PBS pendant trois à cinq minutes à 37 degrés Celsius dans l’incubateur de culture tissulaire et utilisez une pipette de cinq millilitres pour rincer doucement les cellules dissociées du fond de la plaque. Transférer ensuite les cellules dans un tube centrifugeuse de 50 millilitres contenant 25 millilitres de PBS frais. Pour induire l’expression de protéine marquée EGFP dans les cellules de présentation d’antigène dérivées de moelle osseuse, au début du protocole de différenciation cellulaire, diluer les cellules de moelle osseuse à deux à cinq fois 10 à la sixième cellule par millilitre de DMEM plus FBS et la conentration antibiotiques et plaquer les cellules d’un millilitre de milieu par puits, complétée par la cytokine de différenciation appropriée.
Après quatre à six heures dans l’incubateur de culture cellulaire, ajouter deux millilitres de la première série de virus collectés complétés par du polybrene et transduire les cultures cellulaires par centrifugation et une incubation de quatre heures dans l’incubateur de culture cellulaire. À la fin de la période de transduction, transférer les cellules non adhérentes de chaque puits dans des tubes de centrifugeuse individuels de 15 millilitres et recueillir les cellules par centrifugation. Si une plus grande quantité de cellules est nécessaire, les cellules peuvent être infectées avec le même constract dans plusieurs puits et mis en commun avant la différenciation.
Puis re-suspendre les granulés dans 10 millilitres de milieu de culture complétée par la cytokine de différenciation appropriée et plaquer les cellules sur une culture non tissulaire de 10 centimètres traitée boîte de Pétri par tube, pour leur culture de six à huit jours, comme vient de le démontrer. L’évaluation de l’efficacité de la transfection Platinum Eco par cytométrie de flux après la collecte du deuxième virus contenant du supernatent révèle une efficacité moyenne de transfection de 62% pour PSTPIP2-EGFP et de 53% pour OPAL1-EGFP. La transduction rétrovirale n’affecte pas le statut de différenciation des cellules dérivées de la moelle osseuse avec plus de 90% des cellules dans les deux cultures démontrant la positivité pour leurs marqueurs respectifs après transduction avec l’un ou l’autre virus.
Et avec les changements morphologiques appropriés et caractéristiques observés pour les deux types de cellules différenciées. Il convient de noter que l’expression globale de l’EGFP était plus faible dans les cultures cellulaires dendritiques dérivées de la moelle osseuse par rapport à l’expression du macrophage dérivé de la moelle osseuse EGFP, quel que soit le type de rétrovirus. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’utiliser des plats en plastique non tissulaires traités par culture qui sont généralement utilisés pour cultiver des bactéries si vous prévoyez d’enlever les cellules du plat pour l’expérience.
À la suite de cette procédure, d’autres méthodes d’imagerie cellulaire vivante, de microscopie à super résolution ou d’autres types de microscopie peuvent être utilisées pour répondre à d’autres questions sur la localisation et la dynamique sous-cellulaires des protéines dendritiques et macrophages d’intérêt. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’immunologie en explorant la distribution et les relations spaciales des protéines exprimées par les macrophages et les cellules dendritiques et en faisant avancer notre compréhension de la fonction de ces protéines lors des réponses immunitaires. N’oubliez pas que le travail avec des particules virales peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que la réduction de la production d’aérosols, le port d’équipement de protection et l’utilisation d’un capot d’écoulement laminaire, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.
