Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés en neurobiologie, telles que la polarité des motoneurones, la guidage des axones, le trafic d’axone et les mécanismes neurodégénératifs. Le principal avantage de cette technique est d’obtenir une culture hautement enrichie de neurones moteurs pendant que nous prenons pour exprimer notre protéine knockdown par affection minute. Pour commencer cette procédure, placez un embryon dans un plat de dissection média codé avec du silicium.
Sous le microscope, tenir l’embryon avec l’abdomen contre le silicium avec des forceps. Avec la deuxième paire de forceps, insérez l’un des bouts dans le canal central de la moelle épinière rostrad. Ensuite, fermez les forceps pour déchirer légèrement le tissu dorsal.
Répétez cette opération vers le côté connell jusqu’à ce que toute la moelle épinière soit ouverte. Ensuite, placez l’embryon de sorte que la moelle épinière ouverte est contre le silicium. Par la suite, détachez la partie rostrad de la moelle épinière du corps.
Pincer la partie rostrad de la moelle épinière, et tirer l’embryon par la tête pour extraire la moelle épinière. Retirez soigneusement les méninges restantes et les DRG encore attachés à la moelle épinière. Aplatir la moelle épinière sur le silicium et à l’aide d’un scalpel, enlever la moitié dorsale de la moelle en coupant le long du milieu de chaque côté.
Couper la partie centrale en dix morceaux et les transférer dans un nouveau tube. Pour préparer la suspension cellulaire de la moelle épinière, recueillir les morceaux de moelle épinière au fond du tube. Remplacer HBSS par un millilitre de jambon F-10 moyen et ajouter dix microlitres de trypsine.
Incuber le tube pendant dix minutes à 37 degrés Celsius. Pour arrêter la digestion enzymatique, transférez les fragments dans un nouveau tube de 15 millilitres, contenant 800 microlitres de L-15 moyen complet, 100 microlitres de 4%BSA, et 100 microlitres d’ADN et titrisation, deux fois. Laissez les fragments se déposer pendant deux minutes avant de recueillir le surnatant dans un tube frais de 15 millilitres.
Ajouter délicatement deux millilitres de 4%BSA au fond du tube supernatant. Centro le fusionner à 470 x gravité pendant 5 minutes. Après 5 minutes, retirer le supernatant et suspendre à nouveau la palette cellulaire avec 2 millilitres de L-15 moyen complet.
Pour l’enrichissement de motoneuron, divisez la suspension cellulaire en deux tubes de 15 millilitres. Ajouter ensuite deux millilitres de L-15 PH moyen à chaque tube. Si vous commencez avec six embryons, utilisez l’équivalent de trois embryons par tube et de trois millilitres de milieu.
Ajouter lentement 2 millilitres de solution de gradience de densité, au fond de chaque tube pour obtenir une interface nette. Ensuite, centro le fusionner à 830 x gravité pendant 15 minutes à température ambiante. Après cette étape, les petites cellules doivent être au fond du tube, tandis que les grosses cellules - comme le motoneuron - devraient être à la solution de gradient de densité/interface moyenne.
Asperae 1 à 2 millilitres des cellules à l’interface et les transférer dans un tube frais de 15 millilitres. Réglez le volume à dix millilitres avec le milieu L-15 PH. Par la suite, ajouter deux millilitres du coussin 4%BSA au fond des deux tubes.
Et le centro fusionne à 470 x gravité pendant 5 minutes à température ambiante. Après 5 minutes, retirer le supernatant et suspendre à nouveau la palette et 3 millilitres de L-15 moyen complet. Répétez le centrifugage à 470 x gravité pendant 5 minutes à température ambiante.
Ensuite, retirez le supernatant et suspendez la palette cellulaire et deux millilitres de milieu de culture complet. Pour la culture des motoneurones, diluez-les à 5000-10 000 cellules dans 500 microlitres de milieu de culture par puits dans une plaque de puits de 24. Ensuite, retirez la solution laminae avec à la pointe P-1 000 pipet.
Transférer immédiatement les neurones moteurs dilués dans le milieu de la culture. aux plaques de codage pour éviter le séchage. Pour préparer l’ADN, suspendre à nouveau 1 microgramme d’ADN dans 50 microlitres de milieu de culture neuronale.
Et vortex pendant 5 secondes. Pour préparer le tube B, suspendre à nouveau 1,5 microlitres de perles dans 50 microlitres de milieu de culture neuronale. Ajouter 50 microlitres de solution perlée à 50 microlitres de solution d’ADN et incuber pendant 20 minutes à température ambiante.
Au cours de cette incubation, retirez 100 microlitres de milieu culturel du puits qui seront transfectés. Par la suite, transférez 100 microlitres du mélange de perles d’ADN à chaque puits. Et incuber la plaque de puits 24, 20-30 minutes sur la plaque magnétique à 37 degrés Celsius.
Montré ici, est la morphologie de neurone de modem révélée par la position de la chaîne lourde endogène de neurofilament non phosphorylated après quatre jours de culture. Dans ces images, montrez la morphologie de neurone de modem après quatre jours in vitro et transfected pour le gène trans d’EGFP par magnétofection au deuxième jour. Les neurones de devise ont été contre-tachés avec le marqueur SMI-32 ou le marqueur pan-neuro TUJ-1 et les flèches indiquent le soma des neurones.
Ce sont leurs images confocales de neurones moteurs magnéto fected, exprimant type sauvage ou mutant EGFP NEFH construit et taché pour leur marqueur autophagique LC-3B. Les flèches montrent les agrégats mutants de protéine d’EGFP NEFH qui sont également positifs de LC-3B Suivant cette procédure, la curcha de montoholda peut être analysée par microscopie vidéo pour visualiser le trafic d’axons et ajouter quelques conseils. Après son développement initial pour aborder des questions fondamentales en biologie neuronale, cette technique s’avère également être un outil puissant pour explorer les mécanismes pathologiques physio impliquant le spectre des désordres de motoneurone, tels que la maladie toxique de syndrome de choc, la sclérose latérale trophique samuelique, ou l’atrophie musculaire spinale.
