Name: preparation of drosophila larval samples for gas chromatography-mass spectrometry (gc-ms)-based metabolomics
Uploaded: 2018-06-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry GC-MS-based Metabolomics at JoVE.com

Merci aux membres de la Indiana University Mass Spectroscopy Facility et l’Université de l’Utah métabolomique Core Facility d’assistance dans l’optimisation de ce protocole. J.M.T. est pris en charge par le National Institute of General Medical Sciences, de la National Institutes of Health, sous attribution numéro R35GM119557.

1. collecte des œufs
<ol><li>Recueillir des adultes mâles et femelles vierges des génotypes désirées. L’âge individuellement ces animaux dans un flacon de nourriture avec des supports de Bloomington standard pour 3 à 5 jours.</li>
	<li>Mettre en place les accouplements appropriés en transférant 50 femelles vierges et 25 hommes un nouveau flacon de nourriture. NOTE : Un minimum de six accouplements indépendants devrait être mis en place pour chaque génotype. On recueillera seulement un échantillon de chaque croisement (c.-à-d. six échantillons prélevés sur six des accouplements indépendants).</li>
	<li>
Préparer les casquettes de Ponte de mélasse.
	<ol>
<li>Mélangez 115 mL de mélasse et 29 g de gélose avec 700 mL H2O dans un flacon de 2 L.</li>
		<li>Faire bouillir la mélasse mélange agar sur une plaque chauffante.</li>
		<li>Laisser refroidir à 70 ° C.</li>
		<li>Ajouter 25 mL d’acide mix (20 mL d’acide phosphorique à 85 % et l’acide propionique 209 mL dans 1 L de H2O ; Entreposer dans une bouteille brune) et 10 mL d’ester méthylique de l’acide p-hydroxy-benzoïque 10 % dans l’éthanol à 95 %.</li>
		<li>Verser l’agar de mélasse en partie le couvercle et le fond d’un plat de vitroplants de2 35 x 10 mm. Remarque : Avant de verser de mélasse plaques d’agar, n’oubliez pas que les couvercles et/ou de la base de la plaque de2 35 x 10 mm ExacTen dans la bouche d’une solution concentrée de drosophile (décrite dans l’étape 1.6). Selon la marque de plaques utilisées, la base ne peut pas être utilisable.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Faire le pâte en ajoutant de l’eau distillée de levure fraîche active levure sèche (5 g levure/7 mL d’eau) jusqu'à ce que le mélange devient une pâte qui peut se propager facilement sur une surface solide (c.-à-d., la consistance du beurre d’arachide).</li>
	<li>Étaler environ 1,5 g de pâte de levure sur la surface d’une calotte de Ponte de mélasse.</li>
	<li>Introduisez les quatre trous d’air dans les côtés opposés d’un plastique 6 oz Drosophila solution concentrée à l’aide d’une aiguille de 22 G.</li>
	<li>Transférer les mouches accouplées nouvellement dans le flacon de nourriture dans les flacons de culture. Remarque : Les mouches peuvent être transférés en soit à l’aide de CO2 comme anesthésique temporaire ou en tenant le haut du flacon dans la bouche de la bouteille et en tapant fortement le fond de la bouteille contre un sur table.</li>
	<li>Placer rapidement une casquette de Ponte de mélasse avec la pâte de levure sur la surface dans la bouche d’une solution concentrée de drosophile . Bande de laboratoire permet de fixer le capuchon de ponte en place. Remarque : Si les mouches ont été anesthésié avant le transfert, la bouteille devrait figurer horizontalement sur la table jusqu'à ce que toutes les mouches sont rétablis. Une fois que les mouches sont entièrement mobiles, placer le flacon dans un incubateur avec le capuchon de Ponte de mélasse au bas de la culture.</li>
	<li>Replacer le capuchon de Ponte de mélasse au moins une fois par jour pour les deux premiers jours en inversant la solution concentrée, touchant le fond de la bouteille contre la paillasse, enlevant l’ancienne PAC oeuf et plaçant immédiatement un nouveau capuchon de l’oeuf dans la bouche de la bouteille. Jeter le vieux chapeau de ponte. Remarque : Cette étape garantit que les femmes ne tiennent pas leurs oeufs et autorise collection des populations synchronisées.</li>
	<li>Placer un nouveau capuchon de ponte dans la solution concentrée après day 3, remplacer après 2 h et le jeter. Enlever et reboucher la deuxième Ponte après quatre heures. L’étiquette au bas de cette casquette de ponte avec la date, l’heure et le génotype. Remarque : Les œufs récoltés au cours de cette fenêtre 4 h servira pour l’analyse. Cette étape de synchronisation est critique pour analyser des stades de développement spécifiques. Œufs peuvent être collectées de cette manière pendant plusieurs jours.</li>
	<li>Insérer les bouchons de ponte en un Pétri de 60 x 15 mm2 et les placer dans un incubateur à la température et l’humidité.</li>
	<li>Inspecter les capuchons des pontes tous les jours pour des problèmes avec la famine, de la densité de population ou de contamination. Remarque : Les larves doivent avoir accès à une nourriture suffisante pour assurer un développement continu. Si nécessaire, la pâte de levure fraîche peut se propager sur tous les bouchons de ponte qui seront utilisés dans l’expérience. En outre, si la densité de la population larvaire est trop élevée, les larves commencera à se promener hors de la plaque de culture. Ces échantillons ne doivent pas être utilisés pour l’analyse de la métabolomique, parce que la forte densité de population et les épisodes intermédiaires de famine expérimentés tout en errant seront traduira par des données incohérentes. Une densité d’environ 80 à 100 moyen deuxième stade larvaire (L2) par plaque ou 40 – 50 milieu troisième stade larvaire (L3) par plaque est recommandé. Les échantillons qui sont visiblement contaminés par des bactéries ou des champignons doivent être jetés.</li>
</ol>2. prélèvement de l’échantillon larvaire
<ol><li>Âge des larves jusqu’au stade désiré. Si collecte les larves L3, resynchroniser les échantillons à la mue de L2 – L3. Resynchronisation est couramment réalisée en utilisant une méthode décrite précédemment qui utilise les stigmates antérieures comme une étape importante du développement de15. Alternativement, mi-L3 larves peuvent être synchronisées à l’aide d’un de gène de journaliste sgs3 16. Remarque : À cet égard, nous trouvons mi-L2 larves (~ 60 h après la ponte) sont parfaitement adaptés pour la plupart des analyses parce qu’à ce stade, le développement larvaire est encore relativement synchrone, échantillons soigneusement recueillis ont une nourriture suffisante pour développer à ce validant, ainsi que la nombre d’animaux par exemple est gérable (voir ci-dessous). Une étape de synchronisation supplémentaire est nécessaire pour les larves L3 car les impulsions de l’ecdysone nombreux qui se produisent au cours du développement de L3 ont des effets dramatiques sur le métabolisme et généreront des artefacts dans les populations non synchronisées.</li>
	<li>Utiliser une aiguille dissection pour soulever doucement la pâte de levure au large de la gélose. Placer la levure sur un nouveau capuchon de gélose de mélasse. Remarque : La plupart des larves mangeront à l’interface entre l’agar de mélasse et de la pâte à levure.</li>
	<li>Utilisez un petit pinceau pour recueillir les larves de la surface nouvellement exposée de l’agar de mélasse. Placez les larves dans un tube à centrifuger 1,5 mL sur la glace. Remarque : Les tailles d’échantillon appropriée pour chaque stade de développement sont les suivants : 50 premier stade larvaire (L1) ; 25 mi-L2 larves ; larves L3 début 20 ; 15-L3 de milieu ou fin larves L3.</li>
	<li>Laver et congeler les échantillons (étapes 2,3 à 2,8) par petits lots (quatre à six échantillons) tout en rassemblant un ensemble de grands échantillons. Les échantillons doivent être congelés à 20 min de placer des larves dans les tubes. Remarque : Nous vous recommandons d’utiliser Eppendorf 1,5 mL Tubes Flex car les autres tubes risquent d’interférer avec le transfert de l’échantillon à l’étape 3. Échantillons doivent être prélevés dans des microtubes. Ne pas prélever des échantillons dans les tubes de perle décrits à l’étape 3.1. Perles en céramique conservent la solution de lavage de NaCl, qui se traduit par des mesures de masse inexactes et introduit des contaminants dans l’échantillon.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de glacee 0,9 % NaCl dans le tube, fermer le couvercle et verticalement flip le tube à fond pour laver les larves.</li>
	<li>Placer le tube de retour sur la glace pour ~ 30 s. Pendant ce temps, les larves vont couler au fond du tube, mais levure restera en suspension. Une fois que toutes les larves ont formé une boulette de lâche, enlever la solution de NaCl à l’aide d’une pipette de 1 mL.</li>
	<li>Répétez les étape 2.4 et 2.5 deux fois, ou jusqu'à ce que la solution de lavage final est clair. Remarque : Pas de lavage supplémentaire peuvent être nécessaires si l’échantillon contient une quantité excessive de la levure.</li>
	<li>Centrifuger les échantillons à 2 000 × g pendant 1 min à 4 ° C.</li>
	<li>Enlever toute la solution résiduelle à l’aide d’une pipette de 200 µL.</li>
	<li>Congeler immédiatement l’échantillon dans l’azote liquide. Remarque : Le protocole peut être suspendu à cette étape. Échantillons peuvent être conservés jusqu'à 3 mois à-80 ° C.</li>
</ol>3. transférer les échantillons aux perles Tubes
<ol><li>Chaque échantillon de larve doit être transférée dans le tube de microtubes de 1,5 mL à un bouchage des tubes 2 mL contenant les billes en céramique de 1,4 mm. En préparation de cette étape de transfert, utilisez un marqueur de l’éthanol à l’épreuve pour marquer le côté d’un tube de perles de bouchage de 2 mL (marquage sur le couvercle sera détruit au cours de l’étape 4.4).</li>
	<li>Tarer la masse du tube perle étiquetés à l’aide d’une balance analytique permettant de mesurer avec précision 0,01 mg.</li>
	<li>Si les échantillons de larves ont été conservés à-80 ° C, placer les tubes échantillon en avant de l’azote liquide pour transférer.</li>
	<li>Pince longue permet de retirer le tube d’échantillon de 1,5 mL de l’azote liquide dewar.</li>
	<li>Porter des gants de nitrile, prenez la gelée tube, inverser, puis enfoncez fortement le couvercle du tube contre la paillasse pour déloger le culot congelé. Versez immédiatement le culot dans un tube de perles de bouchage préalablement taré 2 mL. Si la pastille ne parvient pas à déloger, retournez le tube à l’azote liquide et répétez. NOTE : Boulettes de larves ne seront pas déloger de toutes les microtubes. Si vous utilisez un tube autre que celle recommandée, déterminer si granulés larvaires peuvent se détacher avant le prélèvement d’échantillons pour analyse.</li>
	<li>Rapidement mesurer la masse totale du tube granule et perle larvaire. Placer immédiatement le tube échantillon dans l’azote liquide. Le culot de larve masse sera utilisé pour normaliser les données de la métabolomique. Remarque : Le protocole peut être suspendu à cette étape. Échantillons peuvent être conservés jusqu'à 3 mois à-80 ° C.</li>
</ol>4. Extraction de l’échantillon
<ol><li>Placer les tubes à échantillon dans un banc de-20 ° C plus froide.</li>
	<li>Ajouter 0,8 mL de méthanol à 90 % prérefroidies (-20 ° C) contenant 2 µg/mL d’acide succinique-d4 dans chaque tube. Retourner l’échantillon à la paillasse de-20 ° C plus frais. Remarque : L’acide succinique-d4 sert comme étalon interne. Utilisez uniquement la HPLC grade H2O et le méthanol. Étant donné que le méthanol et autres solvants organiques sont instables et difficiles à mesurer avec précision à l’aide de pipettes de déplacement d’air, nous recommandons d’utiliser des pipettes à déplacement positif pour cette étape et toutes les étapes suivantes.</li>
	<li>Mettre en place un contrôle négatif en ajoutant 0,8 mL de méthanol à 90 % prérefroidies (-20 ° C) contenant 2 µg/mL d’acide succinique-d4 dans un tube à vide perle.</li>
	<li>Homogénéiser les échantillons pendant 30 secondes à 6,45 m/s en utilisant un homogénéisateur de moulin de perle située dans une salle de contrôle de température de 4 ° C. NOTE : Échec d’homogénéiser les rapidement et complètement le culot larvaire est une source commune de variabilité dans l’analyse de la métabolomique. Utilisez uniquement les homogénéisateurs qui sont capables de détruire congelés tissus larvaires dans les 30 s.</li>
	<li>Retourner les tubes échantillons homogénéisés à-20 ° C applications refroidisseur et les incuber dans un congélateur à-20 ° C pendant au moins 1 h.</li>
	<li>Centrifuger les tubes à 20 000 × g ou maximum vitesse pendant 5 min à 4 ° C pour éliminer le précipité obtenu.</li>
	<li>Transférer 600 µL du liquide surnageant dans un nouveau tube de microtubes de 1,5 mL. Ne pas déranger le précipité. Si la pastille précipitée devient délogée lors de pipetage le surnageant, renvoyer tous les surnageant au tube et répétez l’étape 4.6.</li>
	<li>Placer les tubes échantillon dans une centrifugeuse sous vide. N’oubliez pas que tous les tubes sont ouverts avant de sceller la centrifugeuse. Sécher les échantillons à la température ambiante jusqu'à l’élimination de tous les solvants (cette étape prend habituellement environ 16 h pour terminer). Remarque : Si nécessaire, le protocole peut être suspendu à cette étape. Échantillon séché peut être conservé à-80 ° C.</li>
</ol>5. chimique dérivatisation
<ol><li>Si les échantillons séchés ont été conservés à-80 ° C, placer les tubes échantillon non ouverte dans une centrifugeuse vide et sécher pendant 30 min. Cette étape doit être exécutée avant l’ouverture du tube à essais. Remarque : Cette étape supprime la condensation qui recueille à l’extérieur du tube microtubes lorsque retirés du congélateur. Cette partie du protocole est extrêmement sensible aux H2O et précautions supplémentaires doivent être adoptées pour garder tous les réactifs aussi sèches que possible.</li>
	<li>
Préparer une solution de chlorhydrate de methoxylamine 40 mg/mL (MOX) dans la pyridine anhydre. N’utilisez que la pyridine anhydre. Stocker les MOX et la pyridine dans un dessicateur et préparez la solution de MOX de tous les jours. ATTENTION : MOX et la pyridine sont toxiques. Préparer cette solution sous la hotte.<ol>
<li>Utiliser un pistolet à air chaud pour sécher une seringue de verre de 1 mL.</li>
		<li>Insérer l’aiguille de la seringue dans le flacon de pyridine anhydre. Prélever 1 mL de pyridine et ajouter à un tube à centrifuger contenant 40 mg de MOX.</li>
		<li>Vider la bouteille de pyridine anhydre avec argon. Sceller la bouteille et retourner dans le dessiccateur.</li>
		<li>Dissoudre le MOX dans la pyridine en incubant le tube dans un mélangeur thermique à 35 ° C pendant 10 min à 600 tr/min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajouter 40 µL de MOX de 40 mg/mL dans une solution de pyridine anhydre à l’échantillon séché.</li>
	<li>Vortexer pendant 10 s et centrifuger brièvement (10 000 x g pendant 20 s).</li>
	<li>Incuber à 30 ° C pendant 1 h à 600 tr/min dans un mélangeur thermique.</li>
	<li>Centrifuger à vitesse maximale pendant 5 min retirer les particules de matière ou de 20 000 × g .</li>
	<li>Transférer 25 µL de liquide surnageant dans un flacon pour échantillonneur automatique avec un insert de microvolume verre 250 µL désactivé.</li>
	<li>Ajouter 40 µL de N- méthyl -N- trimethylsilyltrifluoracetamide (MSTFA) contenant 1 % TMCS. ATTENTION : MSTFA est toxique. Effectuez cette étape sous la hotte. Remarque : S’il est disponible, cette étape peut être complétée par un échantillonneur automatique Gerstel.</li>
	<li>Placer un bouchon sur l’auto-échantillonneur et sceller à l’aide d’un outil de sertisseur.</li>
	<li>Incuber les échantillons à 37 ° C pendant 1 heure avec agitation (250 tr/min).</li>
	<li>Préparer une solution d’acide gras méthyl ester standard (FAMES) comme précédemment desceribed3. Ajouter 3 µL de FAMES dans le flacon pour échantillonneur automatique à l’aide d’un échantillonneur robotique immédiatement avant l’injection. Remarque : Les FAMEs sont utilisés pour calibrer le décalage de temps de rétention et de vérifier les performances de l’instrument. Si aucun échantillonneur automatique robotique n’est disponible, les FAMEs peuvent être ajoutés au cours de l’étape 5.8.</li>
</ol>6. GC-MS détection
Remarque : Dans la plupart des cas, l’utilisateur effectuera cette étape avec l’assistance d’un laboratoire central de la spectroscopie de masse. Ce protocole est conçu pour être utilisé avec un 30 m, colonne GC avec une colonne de garde de 5 m.
<ol><li>Randomiser l’ordre de l’échantillon.</li>
	<li>
Préparer la GC-MS.
	<ol>
<li>Régler la vitesse d’écoulement de gaz hélium porteur à 1 mL/min.</li>
		<li>Régler la température d’entrée à 250 ° C.</li>
		<li>Programme de la GC à exécuter le gradient de température suivant :<ol>
<li>Température initiale à 95 ° C, avec une cale de 1 min.</li>
			<li>Augmenter la température à 110 ° C à raison de 40 ° C/min avec une cale de 2 min.</li>
			<li>Augmenter à 250 ° C en rampe de 5° C/min.</li>
			<li>Augmenter à 330 ° C à raison de 25 ° C/min avec un maintien finale de 4 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>La valeur délai solvant 3,5 min. Remarque : La durée peut être modifiée selon le système de la GC-MS. Cette étape vise à empêcher MSTFA et MOX d’endommager le détecteur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injecter 1 µL de l’échantillon de dérivés dans la GC-MS (split ratio de 10:1). NOTE : Injecter 2 µL de l’échantillon, si l’intensité des pics est trop faible. L’ordre d’injection des échantillons devrait être randomisé.</li>
	<li>Exploiter le spectromètre de masse en mode balayage complet sur une gamme de masses de 50 à 500 m/z.</li>
</ol>7. analyse de données
<ol><li>Analyser les données de métabolomique en utilisant soit une approche ciblée ou non ciblée. Analyse ciblée est axée sur la mesure de l’abondance d’un ensemble défini de métabolites, comme les mesures de lactate que nous décrivons ci-dessous. En revanche, l’analyse non ciblée utilise une approche impartiale afin d’identifier toute caractéristique métabolique qui est significativement changée entre deux ensembles d’échantillons. NOTE : Notre laboratoire utilise principalement les programmes gratuits MetAlign17 MetaboAnalyst18,19 pour l’analyse des données. Comme une description adéquate de la contrôle de la qualité, normalisation et étapes de traitement des données sont au-delà de la portée de ce manuscrit, nous renvoyons l’utilisateur à des protocoles plus détaillés qui sont consacrées au traitement des données20,21, 22. En outre, un diagramme qui décrit les étapes requises pour cette analyse se trouvent ailleurs8.</li>
</ol>

<ol>
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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+MetaboAnalyst+3.0+for+comprehensive+metabolomics+data+analysis.">Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).</li><li>Xia, J., Sinelnikov, I. V., Han, B., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MetaboAnalyst+3.0-making+metabolomics+more+meaningful.">MetaboAnalyst 3.0-making metabolomics more meaningful.</a> Nucleic Acids Research. 43 (W1), W251-W257 (2015).</li><li>Lommen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+(pre-)processing+of+nominal+and+accurate+mass+LC-MS+or+GC-MS+data+using+MetAlign.">Data (pre-)processing of nominal and accurate mass LC-MS or GC-MS data using MetAlign.</a> Methods in Molecular Biology. 860, 229-253 (2012).</li><li>Xia, J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+MetaboAnalyst+3.0+for+comprehensive+metabolomics+data+analysis.">Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).</li><li>Xia, J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Web-based+inference+of+biological+patterns,+functions+and+pathways+from+metabolomic+data+using+MetaboAnalyst.">Web-based inference of biological patterns, functions and pathways from metabolomic data using MetaboAnalyst.</a> Nature Protocols. 6 (6), 743-760 (2011).</li><li>Li, H., Tennessen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+the+metabolic+basis+of+Drosophila+development.">Methods for studying the metabolic basis of Drosophila development.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 6 (5), (2017).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Métabolomique fournit une occasion sans pareille d’arpenter les réactions métaboliques qui composent le métabolisme intermédiaire. La sensibilité de cette technologie, toutefois, restitue des données sensibles au bagage génétique, les indices du développement et une variété de contraintes environnementales, y compris la température, l’humidité, la densité de population et la disponibilité des nutriments. Par conséquent, une haute qualité et reproductibles métabolomique analyse exige que les échant...

La drosophile Drosophila melanogaster est apparu comme un système idéal pour étudier les mécanismes moléculaires qui régulent le métabolisme intermédiaire. Non seulement la plupart des voies métaboliques conservées entre la drosophile et les humains, mais capteurs en éléments nutritifs principaux et régulateurs de croissance, comme l’insuline, Tor et myc, sont également actifs dans la mouche1,2. En conséquence, drosophile peut servir à explorer la base métabolique de maladies allant du diabète et l’obésité neurodégénérescence et du cancer. À cet égard, le développement larvaire de Drosophila offre le cadre idéal étudier un programme métabolique appelé glycolyse aérobie, ou l’effet Warburg. A l’instar de plusieurs tumeurs utilisent glycolyse aérobie pour générer la biomasse provenant des glucides, donc pour faire Drosophila larves activent la glycolyse aérobie afin de promouvoir la croissance du développement3,4,5. Ces similitudes entre les larves et le métabolisme de tumeur établir la drosophile comme modèle clé pour comprendre comment aérobie glycolyse est réglementé en vivo.
Malgré le fait que la mouche s’est imposé comme un modèle populaire pour étudier le métabolisme, la plupart des études de drosophile s’appuient sur des méthodes qui sont conçus pour mesurer différents métabolites3, tels que le tréhalose, triglycérides ou ATP. Puisqu’un protocole spécifique est requise pour mesurer chaque métabolite, études sur le dosage sont fastidieux, coûteux et préjugé en faveur de ces composés qui peuvent être mesurés à l’aide de trousses commerciales. Une solution à ces limitations a émergé dans le domaine de la métabolomique, qui fournit un moyen plus efficace et impartial d’étudier le métabolisme de la drosophile . Contrairement à une étude axée sur l’analyse, une analyse unique métabolomique peut simultanément mesure des centaines de métabolites de petites molécules et fournit une compréhension globale de l’organisme un état métabolique6,7. Cette technique a considérablement élargi la portée des études métaboliques de drosophile et représente l’avenir de ce nouveau champ8.
Métabolomique sont principalement menées à l’aide de trois technologies : (i) résonance magnétique nucléaire (RMN), (ii) liquide chromatographie spectrométrie de masse (LC-MS) et (iii) chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS)9. Chaque approche propose des inconvénients et des avantages distincts, et toutes ces technologies ont été utilisées pour étudier avec succès le métabolisme de drosophile . Étant donné que les recherches effectuées dans notre laboratoire se concentre sur les métabolites petits, polaires, nous utilisons principalement une méthode basée sur le GC-MS. GC-MS fournit à l’utilisateur avec un certain nombre d’avantages, notamment une grande reproductibilité, résolution maximale, la sensibilité, et de la disponibilité d’une bibliothèque spectrale standard electron impact (IE), qui permet l’identification rapide des découvertes métabolique caractéristiques10,11. La préparation des échantillons pour GC-MS, cependant, est quelque peu complexe et nécessite une attention minutieuse aux détails. Échantillons doivent être recueillies, lavés, pesés et congelés d’une manière qui apaise rapidement les réactions métaboliques. En outre, la carcasse mouche résiste aux protocoles standard de l’homogénéisation et nécessite un moulin à billes afin d’assurer l’extraction optimale de métabolite. Enfin, les échantillons analysés par GC-MS doivent subir dérivatisation chimique avant la détection12. Alors que les méthodes publiées antérieurement décrivent toutes ces étapes de13,3,14, un protocole visuel qui permettrait à l’utilisateur novice de façon reproductible générer des données de haute qualité est encore nécessaire. Nous démontrons comment préparer des échantillons de larves de drosophile pour analyse métabolomique basée sur GC-MS. Ce protocole permet à l’utilisateur de façon reproductible mesurer beaucoup des petits métabolites polaires qui composent le métabolisme carboné central.

<table><tbody><tr><td>Unsulfured blackstrap molasses</td><td>Good Food, INC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Agar Type II</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-103</td><td></td></tr><tr><td>Pyridine</td><td>EMD Millipore</td><td>PX2012-7</td><td></td></tr><tr><td>Methoxyamine hydrocholoride (MOX)</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>155405</td><td></td></tr><tr><td>MSTFA with 1% trimethylchlorosilane</td><td>Sigma</td><td>69478</td><td></td></tr><tr><td>Fleischmann&amp;rsquo;s Active dry yeast</td><td>AB Mauri Food Inc</td><td>2192</td><td></td></tr><tr><td>6oz Drosophila stock bottle</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-130</td><td></td></tr><tr><td>Soft tissue homogenizing mix (2 mL tubes)&amp;nbsp;</td><td>Omni International</td><td>SKU:19-627</td><td></td></tr><tr><td>Vial insert, 250 &amp;micro;L deactivated glass with polymer feet</td><td>Agilent</td><td>5181-8872</td><td></td></tr><tr><td>Succinic acid-2,2,3,3-d&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>293075</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Thermo&amp;nbsp;</td><td>SC210A</td><td></td></tr><tr><td>o-Phosphoric acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A242-1</td><td></td></tr><tr><td>Propionic acid</td><td>Sigma</td><td>P5561</td><td></td></tr><tr><td>p-Hydroxy benzoic acid methyl ester</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-258</td><td></td></tr><tr><td>Bead Ruptor</td><td>Omni International</td><td>SKU:19-040E</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer F1.5</td><td>Eppendorf</td><td>5384000012</td><td></td></tr><tr><td>MultiTherm Shaker with a 24 X 12 mm block</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H5000</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL centrifuge tube</td><td>Eppendorf</td><td>22364111</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35 X 10 mm tissue culture dish</td><td>Corning Incorporated</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>GC column</td><td>Phenomex</td><td>ZB-5MSi</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of drosophila larval samples for gas chromatography-mass spectrometry (gc-ms)-based metabolomics

Les progrès récents dans le domaine de la métabolomique ont établi la drosophile Drosophila melanogaster comme un puissant modèle génétique pour étudier le métabolisme des animaux. En combinant la vaste gamme d’outils génétiques drosophile avec la possibilité d’arpenter les grandes étendues du métabolisme intermédiaire, une approche métabolomique peut révéler des interactions complexes entre diet, génotype, événements démographiques et des signaux environnementaux. En outre, les études métabolomiques peuvent découvrir de nouveaux mécanismes enzymatiques et découvrir jusque-là inconnues des connexions entre les voies métaboliques apparemment disparates. Afin de faciliter une utilisation plus répandue de cette technologie auprès de la communauté de drosophile , ici, nous fournissons un protocole détaillé qui décrit comment préparer des échantillons de larves de drosophile pour chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS)- base d’analyse de la métabolomique. Notre protocole inclut des descriptions de prélèvement d’échantillons de larves, d’extraction de métabolite, dérivatisation chimique et analyse par CPG-SM. La réussite de ce protocole permettra aux utilisateurs de mesurer l’abondance relative des petits métabolites polaires, y compris les acides aminés, sucres et acides organiques impliqués dans la glycolyse et les cycles TCA.

Lactate déshydrogénase (dLDH) des mutants qui n’ont pas d’activité dLDH4et témoins du même génétiquement ont été recueillis sous forme de larves de milieu-L2 et traitées selon le protocole décrit ci-dessus. Par rapport aux témoins, mutants larves présentent des changements significatifs en lactate et pyruvate L-2-hydroxyglutarate4. Les spectres ont été acquises avec un système d’Agilent GC6890-5973i MS. Un exem...

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Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry GC-MS-based Metabolomics

Ce protocole décrit comment préparer des larves de drosophile pour analyse métabolomique basée sur GC-MS.

Préparation des échantillons de larves de drosophile pour chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS)-base de métabolomique

Recent advances in the field of metabolomics have established the fruit fly Drosophila melanogaster as a powerful genetic model for studying animal ...

preparation-drosophila-larval-samples-for-gas-chromatography-mass

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)-based Metabolomics

11.1K vues.  Indiana University. Ce protocole décrit comment préparer des larves de drosophile pour analyse métabolomique basée sur GC-MS.

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Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often compromise the lives of those who suffer from these complex diseases. Detecting mitochondrial metabolic changes is vital to the understanding of mitochondrial disorders and mitochondrial responses to pharmacological agents. Although mitochondrial metabolism is at the core of metabolic regulation, the detection of subtle changes in mitochondrial metabolism may be hindered by the overrepresentation of other cytosolic metabolites obtained using whole organism or whole tissue extractions. 
Here we describe an isolation method that detected pronounced mitochondrial metabolic changes in Drosophila that were distinct between whole-fly and mitochondrial enriched preparations. To illustrate the sensitivity of this method, we used a set of Drosophila harboring genetically diverse mitochondrial DNAs (mtDNA) and exposed them to the drug rapamycin. Using this method we showed that rapamycin modifies mitochondrial metabolism in a mitochondrial-genotype-dependent manner. However, these changes are much more distinct in metabolomics studies when metabolites were extracted from mitochondrial enriched fractions. In contrast, whole tissue extracts only detected metabolic changes mediated by the drug rapamycin independently of mtDNAs.

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Mitochondria play central roles in the regulation of metabolism and homeostasis. Subtle changes in mitochondrial metabolism that affect organismal physiology could be difficult to detect in whole organism metabolomics studies. Here we describe an isolation method that enhances the detection of subtle metabolic shifts in Drosophila melanogaster.

Préparation de mitochondriales fractions enrichies pour métabolique Analyse en<em&gt; Drosophila</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

Recherche

Biologie du développement

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, organism development, and disease. It is often desirable to obtain PPI information using in vivo material, to gain the most natural and unbiased view of the interaction networks. The fruit fly Drosophila melanogaster is an excellent platform to study PPIs in vivo, and lends itself to straightforward approaches to isolating material for biochemical experiments. In particular, fruit fly embryos represent a convenient type of tissue to study PPIs, due to the ease of collecting animals at this developmental stage and the fact that the majority of proteins are expressed in embryogenesis, thus providing a relevant environment to reveal most PPIs. Here we present a protocol for collection of Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g), which is an ideal amount for a wide range of proteomic applications, including analysis of PPIs by affinity purification-mass spectrometry (AP-MS). We describe our designs for 1 L and 5 L cages for embryo collections that can be easily and inexpensively set up in any laboratory. We also provide a general protocol for embryo collection and protein extraction to generate lysates that can be directly used in downstream applications such as AP-MS. Our goal is to provide an accessible means for all researchers to carry out the analyses of PPIs in vivo.

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

The goal of this protocol is to provide a straightforward and inexpensive approach to collecting Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g) and preparing protein extracts that can be used in downstream proteomic applications, such as affinity purification-mass spectrometry (AP-MS).

Préparation à moyen terme de<em&gt; Drosophila</em&gt; Extraits d&#39;embryons pour les expériences protéomiques

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology, which all influence muscle development and myofibrillogenesis. Omics data, such as those generated by mass spectrometry or deep sequencing, can provide important mechanistic insights into these biological processes. For such approaches, it is beneficial to analyze tissue-specific samples to increase both selectivity and specificity of the omics fingerprints. Here we present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched muscle samples for omics applications. We first describe how to dissect flight muscles at early pupal stages (&#60;48 h after puparium formation [APF]), when the muscles are discernable by green fluorescent protein (GFP) labeling. We then describe how to dissect muscles from late pupae (&#62;48 h APF) or adults, when muscles are distinguishable under a dissecting microscope. The accompanying video protocol will make these technically demanding dissections more widely accessible to the muscle and Drosophila research communities. For RNA applications, we assay the quantity and quality of RNA that can be isolated at different time points and with different approaches. We further show that Bruno1 (Bru1) is necessary for a temporal shift in myosin heavy chain (Mhc) splicing, demonstrating that dissected muscles can be used for mRNA-Seq, mass spectrometry, and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) applications. This dissection protocol will help promote tissue-specific omics analyses and can be generally applied to study multiple biological aspects of myogenesis.

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology. We present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched samples ideal for proteomics and deep-sequencing. These samples can offer important mechanistic insights into diverse aspects of muscle development.

Dissection des muscles de vol de melanogaster de Drosophila pour des approches d'Omics

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

Génétique

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

Appétitive apprentissage olfactif associatif en<em&gt; Drosophila</em&gt; Les larves

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Neurosciences

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and behavioral evolution. Drosophila olfactory tissues house the olfactory receptor neurons (ORNs) that detect volatile chemical cues in addition to hydro- and thermo-sensory neurons. In this protocol, we describe the dissection of developing peripheral olfactory tissue of the adult Drosophila species. We first describe how to stage and age Drosophila larvae, followed by the dissection of the antennal disc from early pupal stages, followed by the dissection of the antennae from mid-pupal stages and adults. We also show methods where preparations can be utilized in molecular techniques, such as the RNA extraction for qRT-PCR, RNAseq, or immunohistochemistry. These methods can also be applied to other Drosophila species after species-specific pupal development times are determined, and respective stages are calculated for appropriate aging.

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Here, we present a protocol to stage and dissect developing olfactory tissue from Drosophila species. The dissected tissue can later be used for molecular analyses, such as quantitative RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) or RNA sequencing (RNAseq), as well as in vivo analyses such as immunohistochemistry or in situ hybridization.

Préparer le développement de tissu olfactif périphérique pour moléculaire et analyse Immunohistochemical chez la drosophile

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and ...

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, Drosophila research lacks popularity in developing countries, possibly due to the misinformed idea that establishing a lab and performing relevant experiments with such tiny insects is difficult and requires expensive, specialized apparatuses. Here, we describe how to build an affordable flylab to quantitatively analyze a myriad of behavioral parameters in D. melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We provide protocols to build in-house vial racks, courtship arenas, apparatuses for locomotor assays, etc., to be used for general fly maintenance and to perform behavioral experiments using adult flies and larvae. We also provide protocols on how to use more sophisticated systems, such as a high resolution oxygraph, to measure mitochondrial oxygen consumption in larval samples, and show its association with behavioral changes in the larvae upon the xenotopic expression of the mitochondrial alternative oxidase (AOX). AOX increases larval activity and mitochondrial leak respiration, and accelerates development at low temperatures, which is consistent with a thermogenic role for the enzyme. We hope these protocols will inspire researchers, especially from developing countries, to use Drosophila to easily combine behavior and mitochondrial metabolism data, which may lead to information on genes and/or environmental conditions that may also regulate human physiology and disease states.

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

We provide protocols for anyone with a "maker culture" mind to start building a flylab for quantitative analysis of a myriad of behavioral parameters in Drosophila melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We also describe a high resolution respirometry protocol using larvae to combine behavioral and mitochondrial metabolism data.

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, ...

Sciences du comportement

Analysis of Lipid Signaling in Drosophila Photoreceptors using Mass Spectrometry

The activation of phospholipase C&#946; (PLC&#946;) is an essential step during sensory transduction in Drosophila photoreceptors. PLC&#946; activity results in the hydrolysis of the membrane lipid phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate [PI(4,5)P2] leading ultimately to the activation of transient receptor potential (TRP) and TRP like (TRPL) channels. The activity of PLC&#946; also leads subsequently to the generation of many lipid species several of which have been proposed to play a role in TRP and TRPL activation. In addition, several classes of lipids have been proposed to play key roles in organizing the cell biology of photoreceptors to optimize signaling reactions for optimal sensory transduction. Historically, these discoveries have been driven by the ability to isolate Drosophila mutants for enzymes that control the levels of specific lipids and perform analysis of photoreceptor physiology in these mutants. More recently, powerful mass spectrometry methods for isolation and quantitative analysis of lipids with high sensitivity and specificity have been developed. These are particularly suited for use in Drosophila where lipid analysis is now possible from photoreceptors without the need for radionuclide labeling. In this article, the conceptual and practical considerations in the use of lipid mass spectrometry for the robust, sensitive, and accurate quantitative assessment of various signaling lipids in Drosophila photoreceptors are covered. Along with existing methods in molecular genetics and physiological analysis such lipid is likely to enhance the power of photoreceptors as a model system for discoveries in biology.

Analysis of Lipid Signaling in Drosophila Photoreceptors using Mass Spectrometry

The manuscript presents versatile, robust, and sensitive mass spectrometry protocols to identify and quantify several classes of lipids from Drosophila photoreceptors.

The activation of phospholipase C&#946; (PLC&#946;) is an essential step during sensory transduction in Drosophila photoreceptors. PLC&#946; activity ...

Biochimie

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

Analyse métabolique des larves de Drosophila melanogaster et un cerveau adulte

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

Purification des relevés de notes et de métabolites<em&gt; Drosophila</em&gt; Têtes

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Biologie

Surveillance du transport des métabolites cérébraux chez la drosophile à l’aide de capteurs FRET

Visualizing Monocarboxylates and Other Relevant Metabolites in the Ex Vivo Drosophila Larval Brain Using Genetically Encoded Sensors

The high energy requirements of brains due to electrical activity are one of their most distinguishing features. These requirements are met by the production of ATP from glucose and its metabolites, such as the monocarboxylates lactate and pyruvate. It is still unclear how this process is regulated or who the key players are, particularly in Drosophila.
Using genetically encoded F&#246;rster resonance energy transfer-based sensors, we present a simple method for measuring the transport of monocarboxylates and glucose in glial cells and neurons in an ex-vivo Drosophila larval brain preparation. The protocol describes how to dissect and adhere a larval brain expressing one of the sensors to a glass coverslip. 
We present the results of an entire experiment in which lactate transport was measured in larval brains by knocking down previously identified monocarboxylate transporters in glial cells. Furthermore, we demonstrate how to rapidly increase neuronal activity and track metabolite changes in the active brain. The described method, which provides all necessary information, can be used to analyze other Drosophila living tissues.

Pleins feux sur l’auteur : Avancées dans la recherche sur le métabolisme énergétique cérébral à l’aide du modèle de la drosophile

Here we present a protocol to visualize the transport of monocarboxylates, glucose, and ATP in glial cells and neurons using genetically encoded F&#246;rster resonance energy transfer-based sensors in an ex-vivo Drosophila larval brain preparation.

Visualisation des monocarboxylates et d’autres métabolites pertinents dans le cerveau larvaire de la drosophile ex vivo à l’aide de capteurs génétiquement codés

Préparation des échantillons de larves de drosophile pour chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS)-base de métabolomique

Résumé

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Chapitres dans cette vidéo

Préparation de mitochondriales fractions enrichies pour métabolique Analyse en

Préparation à moyen terme de

Dissection des muscles de vol de melanogaster de Drosophila pour des approches d'Omics

Appétitive apprentissage olfactif associatif en

Préparer le développement de tissu olfactif périphérique pour moléculaire et analyse Immunohistochemical chez la drosophile

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

Analysis of Lipid Signaling in Drosophila Photoreceptors using Mass Spectrometry

Analyse métabolique des larves de Drosophila melanogaster et un cerveau adulte

Purification des relevés de notes et de métabolites

Visualisation des monocarboxylates et d’autres métabolites pertinents dans le cerveau larvaire de la drosophile ex vivo à l’aide de capteurs génétiquement codés