La preparación de muestras criogénicas enfrenta desafíos que pueden limitar su efectividad, particularmente la distribución desigual de partículas. Este problema a menudo conduce a una resolución deficiente y una precisión reducida en las estructuras de proteínas recién construidas. Se utilizan varios enfoques experimentales para superar la distribución desigual de las partículas, incluida la adición de detergentes o imitadores de membrana a la muestra, la modificación de la película de soporte de la rejilla y la inclinación de una etapa específica durante la recopilación de datos.
Este protocolo analiza un método práctico simple para abordar la distribución desigual de partículas a través de la optimización de la preparación de muestras, proporcionando nuestra referencia para que los investigadores ilustren de manera eficiente las estructuras de macromoléculas utilizando criógeno. Para comenzar, recoja las fracciones de proteína agrupadas que contienen la proteína de choque térmico pequeña MJ 16.5. Utilice filtros centrífugos con un límite de peso molecular de 50 kilodalton para concentrar las fracciones a cuatro grados Celsius a aproximadamente 65 miligramos.
Después de la concentración, centrifugar la muestra a 16.000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados para eliminar los agregados. Alícuota de 50 volúmenes de microlitros del sobrenadante en tubos de PCR de pared delgada de 0,2 mililitros. Para la microscopía electrónica de transmisión, descongele dos tubos de proteínas congeladas en hielo.
Una vez descongelado, agite el tubo varias veces para mezclar. A continuación, centrifugar la solución proteica a 16.000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados para eliminar los agregados. A continuación, inyecte el sobrenadante en una columna de cromatografía de exclusión por tamaño y recoja fracciones de elución de 0,5 mililitros.
Recoja las fracciones elucianas correspondientes al pico, que exhiben la absorbancia ultravioleta más alta a 280 nanómetros. Para el intercambio de tampones, con unas tijeras, corte una membrana de diálisis en trozos de 30 por 30 milímetros. Incubar las piezas en agua destilada o soluciones tampón para equilibrarlas.
A continuación, agregue 55 microlitros de la solución de proteínas a una cámara con botones de microdiálisis de 50 microlitros. Sostenga la membrana de diálisis verticalmente con pinzas y toque suavemente un borde de la membrana contra el papel de seda para drenar el exceso de líquido. Cubra cuidadosamente el botón de microdiálisis con la membrana.
Coloque la junta tórica en la parte superior de la membrana de diálisis y gírela suavemente en la ranura del borde del botón. Sumerja cada botón de diálisis en un vaso de precipitados separado que contenga el tampón de destino con el lado de la membrana hacia arriba. Utilice una jeringa con una aguja fina para perforar cuidadosamente la membrana y recuperar la solución proteica de la cámara de microdiálisis.
Cargue cinco microlitros de la muestra a una concentración de 20 a 120 nanogramos por mililitro en una rejilla de descarga incandescente. Prepare tres gotas de agua de 50 microlitros cada una en una hoja de película de parafina. Frote la superficie de la rejilla contra las gotas de agua para lavar la muestra.
Ahora cargue cinco microlitros de solución filtrada de acetato de urinario al 1% en la rejilla e inmediatamente pipetee la solución de acetato de urinario. Cargue otros cinco microlitros de la solución de acetato para urinarios en la rejilla. Toque suavemente el lado de la pinza de la rejilla con papel de filtro para eliminar el exceso de solución de tinción y deje que la rejilla se seque.
Monte las pinzas y el conjunto de rejilla de descarga incandescente en el instrumento. A continuación, cargue cuatro microlitros de la muestra en el lado de carbono de la rejilla. Inicie el proceso de congelación por inmersión.
Para preparar las rejillas para cargarlas en el microscopio electrónico de transmisión, o TEM, primero coloque una caja de rejilla que contenga rejillas vitrificadas en la estación de ensamblaje de rejilla automática y desenrosque la tapa de una caja de rejilla que contiene rejillas vitrificadas. Coloque el anillo de rejilla automática en el espacio de recorte designado en la estación de montaje. Mueva con cuidado la rejilla vitrificada de la caja de rejilla y colóquela dentro del anillo de rejilla automática.
Ahora alinee el disco para colocar la abertura circular en la parte superior del anillo de rejilla automática y el ensamblaje de rejilla. Para fijar la rejilla en el anillo de rejilla automática, coloque la herramienta de inserción de clip C en la parte superior de la rejilla y presione suavemente hacia abajo para asegurar el clip C en su interior. Gire el disco hacia atrás y mueva las rejillas ensambladas a la caja de almacenamiento de rejilla automática.
Ensamble la estación de carga de casetes y enfríela con nitrógeno líquido. Coloque la caja de almacenamiento de rejilla automática en la estación de carga. Mueva el ensamblaje de rejilla de la caja de almacenamiento de rejilla automática al casete.
Utilice el asa para colocar el casete en la cápsula del cargador automático. Revise el pin en el cargador automático para confirmar su libre movimiento y asegurarse de que no esté congelado. Se observó la acumulación de partículas en las matrices en todas las cuadrículas probadas, independientemente de las condiciones de amortiguación o las modificaciones de la carga superficial.
Una mayor concentración de proteína combinada con rejillas cargadas negativamente en nueve milimolares de mobstress, 50 milimolares de cloruro de sodio y 0,1 milimolares de tampón EDTA dio como resultado la distribución deseada de partículas individuales dentro de los agujeros de la rejilla, reduciendo la formación de matrices de proteínas. Esta condición optimizada condujo a un alto valor de relación de área FSC cónica de 0,80 y un valor SCF de 0,859, lo que confirma una distribución uniforme de las partículas.
