La alta acumulación de hierro en el cerebro en BPAN es causada por una disfunción de la proteína de autofagia. Pero se desconocen los mecanismos moleculares subyacentes. Este protocolo proporciona una evaluación de la degradación de la ferritina lisosomal, como la ferritinofagia.
Esta técnica ofrece el método de análisis cuantitativo basado en imágenes para medir la degradación de la ferritina lisosomal en células individuales. Convenientemente, el enfoque multiplex se puede ampliar mediante la inclusión de anticuerpos o colorantes apropiados para medir parámetros celulares adicionales. Este método puede identificar y diferenciar las vías dependientes e independientes de la autofagia para la degradación de la ferritina lisosomal.
Es importante para comprender la homeostasis disfuncional del hierro en BPAN a nivel celular. Nuestra doctorando, Carmen Pastor-Maldonado, demostrará el método para analizar la degradación de la ferritina lisosomal, como la ferritinofagia. Comience la autofijación aspirando el medio de tratamiento de las células de neurodegeneración asociadas a la hélice beta derivadas del paciente asentadas en una placa de 96 pocillos con fondo de vidrio y lavándolas dos veces con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, o DPBS.
Agregue 100 microlitros de paraformaldehído al 3,7%, o PFA, por pocillo antes de fijar las celdas durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de 20 minutos, retire el PFA y lave las células dos veces con PBST antes de bloquear las células en PBST que contienen 1% de albúmina sérica bovina, o BSA, durante una hora a cuatro grados centígrados. A continuación, lave las células dos veces con PBST antes de aplicar 50 microlitros de la mezcla de anticuerpos primarios preparada en PBST por pocillo.
Envuelva las placas con parafilm e incube durante la noche a cuatro grados centígrados. A la mañana siguiente, prepare la mezcla de anticuerpos secundarios en PBST en una proporción de uno a 200. Después de lavar las células dos veces con PBST, aplique 50 microlitros de la mezcla de anticuerpos secundarios recién preparada por pocillo.
Incubar las células a cuatro grados centígrados durante una hora en la oscuridad. Nuevamente, dé dos lavados con PBST, y agregue 100 microlitros de cinco microgramos por microlitros recién preparados de solución de 4'6-diamidino-2-fenilindol, o DAPI, por pocillo e incube la placa. Dé dos lavados de PBS antes de agregar 50 microlitros de PBS a cada pocillo, luego incube las placas envueltas a cuatro grados en la oscuridad.
Para obtener imágenes automatizadas de las células, reemplace el PBS en la placa con 50 microlitros de PBS fresco a temperatura ambiente. Cubra la placa con papel de aluminio para transferirla a la sala de microscopía. Encienda el microscopio de escaneo láser confocal, coloque un soporte de muestras para placas de 96 pocillos en la mesa del microscopio y seleccione un objetivo de 40x.
Ajuste la configuración de imagen seleccionando los láseres y los filtros en Smart Setup, y asignando las pistas para obtener una calidad y velocidad de imagen óptimas. Para seleccionar el tipo de experimento, haga clic en Mosaicos"para habilitar la opción de selección y guardar las posiciones XY determinadas en la placa. En el módulo "Configuración de imágenes", visualice los canales de adquisición, las pistas asignadas y sus longitudes de onda de excitación y emisión.
En el módulo "Modo de adquisición", seleccione "Velocidad de escaneo" como seis, "Dirección" como bidireccional, "Promedio" como 2x y "Bits por píxel" como ocho. En el módulo de canales, ajuste la potencia del láser, el estenopeico y la ganancia maestra de cada canal individualmente para lograr imágenes correctamente expuestas sin sobresaturarlas. A continuación, haga clic en el módulo "Estrategia de enfoque" y seleccione Combinar enfoque automático de software y enfoque definido.
En Canal de referencia y desplazamientos, seleccione el canal más estable y brillante como referencia. En Repeticiones y frecuencia de eventos de estabilización, seleccione Estándar. En el módulo "Enfoque automático del software", seleccione Modo "como intensidad", Búsqueda "como inteligente", Muestreo "como fino" y Rango relativo.
A continuación, haga clic en el módulo "Mosaicos". Seleccione las posiciones como Posiciones individuales. En Configuración avanzada, navegue a través de la placa, identifique una posición para la obtención de imágenes y haga clic en el botón debajo de la pestaña Configuración de posición.
Para etiquetar cada posición con información adicional, abra la pestaña "Propiedades" y haga clic en el icono de la rueda junto al menú desplegable de la categoría, luego haga clic en Nuevo"para abrir un nuevo cuadro de diálogo para ingresar un nuevo nombre de categoría. Para asignar una categoría a una posición determinada, seleccione la posición, haga clic en la pestaña "Propiedades", vaya al menú desplegable de categorías y seleccione la etiqueta correspondiente. En Portador de muestras, seleccione Multiwell 96 Cellvis glass bottom 0.
Haga clic en "Calibrar" para calibrar el microscopio con la superficie de la placa. Elija entre una calibración de punto o de siete puntos en función de las especificaciones del sistema. En Opciones, seleccione una superposición de mosaicos del 10%En Viajar en regiones de mosaicos, seleccione Peine y marque Usar velocidad de etapa desde Stage Control, Usar aceleración de etapa desde Stage Control y Pirámide de imagen durante la adquisición.
Una vez hecho esto, ejecute la adquisición de imágenes, guarde los resultados de la imagen como archivo CZI y los metadatos de la imagen como archivos CSV en un disco duro portátil. Exporte las imágenes como archivos TIF. Cree un archivo de hoja de cálculo de metadatos independiente para el análisis de imágenes de alto rendimiento con las columnas de posición, pozo, condición, serie y conjunto.
Recupere los datos apropiados del archivo de metadatos original que proviene de la microscopía de escaneo láser confocal y rellene estas columnas. Inicie CellProfiler 4.2.4 haciendo doble clic e importe la canalización de CellProfiler arrastrando y soltando. Antes de adaptar la canalización de CellProfiler, arrastre y suelte archivos de imagen CZI individuales, o una carpeta que contenga varios archivos de imagen CZI, en el módulo de imagen.
En el módulo "NamesAndTypes", sustituya el código C1-C3 por un código que permita al software identificar y ordenar las imágenes de un solo canal que se van a analizar. Para optimizar las entradas numéricas de los módulos, ajuste la configuración de la canalización para los módulos IdentifyPrimaryObjects "e IdentifySecondaryObjects". Para realizar un seguimiento de los ajustes, seleccione la opción modo de prueba haciendo clic en el botón "Iniciar modo de prueba" o, alternativamente, el botón "Paso" entre los módulos A. Esto dará como resultado una ventana emergente que muestra cómo se analizaría una imagen con esa configuración.
Ajuste la configuración para un reconocimiento óptimo. Una vez que se haya optimizado la canalización, finalice el modo de prueba y ejecute el análisis activando el modo de prueba de salida antes de hacer clic en el botón "Analizar imágenes". Después del análisis, verifique la precisión de la detección de celdas y puntos comparando las imágenes de entrada con las salidas de superposición generadas por CellProfiler.
Si no es satisfactorio, ajuste los valores numéricos en los diferentes módulos hasta que el resultado del análisis sea lo suficientemente preciso. Esta técnica hizo posible el reconocimiento celular basado en software y el reconocimiento de ferritina y LAMP2. Cuando se bloqueó la degradación lisosomal de la ferritina mediante la adición de bafilomycin A1, la colocalización de la ferritina endógena en LAMP2 aumentó.
El aumento fue consistente con su capacidad para inhibir las enzimas lisosomales V-ATPasa que bloquean la ferritinofagia. La inmunotinción de alta calidad es obligatoria para analizar las imágenes de forma precisa y automática, por lo que es aconsejable realizar experimentos preliminares para probar cosas como diluciones de anticuerpos y densidades celulares. Este protocolo se puede ampliar para realizar análisis de microscopía óptica y electrónica correlativos.
Para ello, se pueden extraer conclusiones precisas, pero el tipo de degradación de la ferritina lisosomal, por ejemplo, a través de la ferritinofagia o por vías independientes de la autofagia. Estas estrategias se están probando para determinar si pueden capturar el comportamiento celular específico de las células derivadas de pacientes con BPAN, y la diferencia con las células donde. No está mutado.
Este método es parte de ese desarrollo.
