El protocolo proporciona una alternativa no quirúrgica precisa, segura y eficiente a los métodos tradicionales de inyección quirúrgica y ciega. También es la técnica de inyección más precisa para los timos atrofiados en ratones ancianos o inmunodeficientes. La ventaja clave es un procedimiento de inyección mínimamente estresante que es muy seguro y preciso, pero también rápido, lo que permite experimentos a gran escala sin comprometer los datos de la inmunosupresión relacionada con el estrés quirúrgico.
Mantener la alineación de la aguja y el transductor mientras se avanza a través de la pared torácica requiere algo de práctica. Por lo tanto, recomendamos colaborar con un radiólogo intervencionista experimentado para realizar inyecciones o proporcionar capacitación. Ayudando a demostrar el procedimiento estará Shaina Anuncio, una técnica de mi laboratorio.
Para comenzar, aplique una capa delgada de crema depilatoria en el área anterior del pecho de los ratones durante menos de un minuto para eliminar el pelaje. Use una toalla de papel húmeda para quitar la crema y el pelaje suelto. Confirme la profundidad anestésica apropiada por falta de respuesta al pellizco de la pata trasera.
Aplique ungüento oftálmico en ambos ojos para evitar el secado de la córnea. Coloque un ratón a la vez en posición supina en la plataforma calentada de la estación de imágenes de ultrasonido de animales pequeños con el cono de la nariz en su lugar. Asegure el ratón al escenario con cinta adhesiva médica en las extremidades posteriores y delanteras.
Desinfecte la piel de la parte superior del tórax sin pelaje con un aplicador de gluconato de clorhexidina. Active la sonda lineal de frecuencia más alta disponible. Por lo general, la sonda con la resolución espacial más alta para el tamaño del animal que se está fotografiando.
Active la sonda tocando el botón correspondiente después de la pantalla de inicio. Para optimizar la configuración de ultrasonido para imágenes e inyección, ajuste la profundidad del campo de visión a un tamaño apropiado para el animal objetivo ajustando los controles deslizantes orientados verticalmente en el lado derecho de la pantalla. Ajuste la ganancia de escala de grises deslizando el botón a lo largo de la barra horizontal en la parte inferior de la pantalla.
Luego, ajuste la zona focal al nivel anticipado del timo. Aplique aproximadamente un mililitro de gel de ultrasonido a la superficie del transductor mientras está en posición vertical, ya sea descansando en el soporte de la máquina de ultrasonido o en las manos de un asistente. Para preparar un pequeño campo estéril junto a la plataforma calentada, vacíe una cubierta de sonda estéril, una banda elástica, guantes estériles y gel de ultrasonido estéril en el campo estéril.
Luego, póngase los guantes estériles. Coloque con cuidado la cubierta estéril de la sonda sobre el transductor de ultrasonido y el gel. Para mantener la esterilidad, toque solo la cubierta estéril.
Deslice la banda elástica estéril sobre la cubierta de la sonda para mantenerla en su lugar. Coloque de dos a tres mililitros de gel de ultrasonido estéril en el transductor. Coloque la sonda de ultrasonido con tapa de gel verticalmente en la parte desinfectada de la pared torácica anterior del ratón para obtener imágenes iniciales, mientras mantiene la esterilidad.
Vea y optimice la imagen de ultrasonido como se demostró anteriormente. Para escanear el pecho anterior del ratón en un plano transversal, sostenga el transductor verticalmente y muévalo hacia arriba y hacia abajo desde el cuello hasta el abdomen en un movimiento similar a un pincel o de barrido. Con el corazón centrado en el campo de visión, barre el transductor ligeramente hacia el cuello.
Tenga en cuenta las dos estructuras negras emparejadas redondas a cada lado de la parte superior del pecho. Usando la sonda de ultrasonido, localice la porción más ancha del timo, que generalmente es el sitio objetivo ideal para la inyección. Anticipe una trayectoria horizontal de la aguja en la ubicación elegida y observe dónde se encuentran los vasos sanguíneos principales en este sitio.
Estos vasos deben evitarse durante la inyección. Los vasos sanguíneos serán estructuras pulsátiles hipoecoicas. Si no está seguro, active el modo Doppler color tocando el botón de color en la pantalla para verificar el flujo dentro de los vasos.
Sostenga el transductor en una mano y una aguja de insulina de calibre 30 con 10 microlitros de inyección en la otra. Para comenzar el proceso de inyección, mueva el transductor lateralmente para que el timo esté descentrado en el campo de visión del ultrasonido. Asegúrese de que el otro lado del campo de visión consista principalmente en gel de ultrasonido y nada más.
Coloque la punta de la aguja en el gel debajo del transductor y mueva lentamente la aguja hasta que se visualice adyacente a la superficie de la piel. Mientras toma imágenes continuamente de la aguja bajo ultrasonido, inserte la aguja en la glándula del timo con una trayectoria percutánea lejos de los vasos sanguíneos. Utilice una trayectoria horizontal transversal del timo para colocar la punta de la aguja en el lóbulo tímico contralateral al sitio de entrada.
Una vez que la punta de la aguja esté dentro de la porción deseada del timo, inyecte rápidamente el contenido de la jeringa de calibre 30 mientras usa la visualización ecográfica. Para estabilizar la jeringa durante la inserción e inyección de la aguja, sostenga la jeringa entre el pulgar y el tercer dedo, y controle el émbolo de la jeringa con el dedo índice. Retire la aguja después de que se haya depositado todo el contenido.
En ratones jóvenes, la identificación de la glándula timo fue sencilla debido al gran tamaño de la glándula. Fue más desafiante en ratones más viejos o inmunodeficientes. Sin embargo, todavía era muy factible con equipos de ultrasonido modernos.
La inyección exitosa se observó cuando la aguja no atravesó estructuras críticas, como el corazón, la aorta o una de las venas cavas inferiores. La punta de la aguja se visualizó en su ubicación objetivo durante la inyección, confirmando la deposición intratímica. La localización intratímica de la inyección se confirmó utilizando luciferina como inyectado en ratones transgénicos con luciferasa.
Estos fueron evaluados inmediatamente con imágenes de bioluminiscencia, confirmando la ubicación correcta de la inyección sin sacrificar al animal. Alternativamente, se inyectó Trypan Blue como marcador visual del sitio de inyección y la precisión de la inyección utilizando ex vivo con necropsia. Nuestro grupo ha estado utilizando esta técnica para varios estudios grandes, incluida la investigación de inmunoterapia contra el cáncer, basada en la inyección de células progenitoras modificadas genéticamente, y para mejorar la función tímica en ratones inmunodeficientes.
