Este protocolo permite nuevos conocimientos sobre la microbiota natural de C.elegans. Simultáneamente, los microbios aislados se pueden utilizar en experimentos de laboratorio controlados para caracterizar las interacciones microbiota-huésped y la biología de C. elegans. Este protocolo se centra en aislar microbios asociados con C.elegans en la naturaleza, que por lo tanto son clave para comprender la biología de este importante huésped modelo en un contexto más natural.
Será útil estar familiarizado con la apariencia de Caenorhabditis en comparación con otros nematodos. El pipeteo bajo el alcance de disección puede ser inicialmente un desafío, pero la práctica será útil. Comience recolectando las muestras ambientales como compost o frutas podridas en bolsas de plástico separadas, tubos o recipientes limpios.
Extienda uniformemente las piezas de las muestras ambientales recolectadas en una placa de Petri vacía estéril de nueve centímetros y agregue aproximadamente 20 mililitros de medio viscoso estéril para cubrir la muestra con el medio. Bajo el microscopio de disección, busque nematodos Caenorhabditis siguiendo las pautas para aislar Caenorhabditis elegans y nematodos relacionados. Usando una pipeta de 20 a 100 microlitros, recoja la menor cantidad posible de líquido que contenga los nematodos Caenorhabditis de la placa y transfiérala a la placa de Petri de tres centímetros que contiene de uno a tres mililitros de M9T estéril.
Para establecer una población de gusanos, los gusanos individuales pueden transferirse a una placa con un medio de crecimiento de nematodos o NGM. Para lavar los nematodos y eliminar los microbios presentes fuera de los nematodos, incubarlos en M9T durante 10 a 15 minutos. Pipetear la menor cantidad posible de líquido que contenga los nematodos y transferirlo a una nueva placa de Petri estéril de tres centímetros que contenga de uno a tres mililitros de M9T fresco.
Para la identificación imparcial de microbios asociados a nematodos, prepare una placa de 96 pocillos con aproximadamente tres perlas estériles de un milímetro de diámetro y agregue una mezcla de 19.5 microlitros de tampón de PCR y 0.5 microlitros de proteinasa K por pocillo. Transfiera un solo nematodo lavado a cada pocillo con el menor líquido posible. Rompa los nematodos transferidos usando un homogeneizador de perlas durante tres minutos a 30 hercios y centrifugue las placas o tubos a 8, 000 G durante 10 segundos a temperatura ambiente para que el líquido llegue al fondo.
Para identificar C. elegans, caliente las muestras en un ciclador de PCR durante una hora a 50 grados centígrados y 15 minutos a 95 grados centígrados para aislar el ADN de nematodos individuales, o use kits comerciales para aislar el ADN de las poblaciones de gusanos. Congele el ADN aislado a menos 20 grados centígrados para su almacenamiento a largo plazo. Utilice el ADN y el par de cebadores NLP 30 hacia adelante y NLP 30 hacia atrás y produzca un producto de PCR de 154 pares de bases.
Para aislar las bacterias, prepare una placa de 96 pocillos con aproximadamente tres perlas estériles de un milímetro, 20 microlitros de tampón M9 por pocillo y pipete un solo nematodo lavado a cada pocillo con el menor líquido posible. Rompa los nematodos como se demostró antes de usar un homogeneizador de perlas, seguido de una breve centrifugación de la placa para llevar el líquido al fondo. Una vez hecho esto, recoja la suspensión y diluyala en serie en una proporción de uno a 10.
Placa de hasta 100 microlitros de la suspensión diluida en placas de agar de nueve centímetros. Luego incubar las placas a 15 a 20 grados centígrados durante 24 a 48 horas. Para obtener el cultivo bacteriano puro, elija una sola colonia de la placa incubada usando un asa estéril o palillo de dientes y raye en una nueva placa de agar que contenga el mismo medio de agar utilizado durante la purificación.
Asegúrese de usar solo 1/3 de la placa. Luego esterilice un bucle reutilizable o use un nuevo bucle estéril y arrástrelo a través de la primera raya para crear una segunda raya en otra parte de 1/3 de la placa de muestra. Repítalo arrastrando un bucle a través de la segunda racha y creando la tercera racha para lograr el crecimiento de una sola colonia.
Incubar la placa en las mismas condiciones de crecimiento utilizadas para el aislamiento y, si es necesario, repetir el paso de purificación. Cultive las colonias puras en un medio líquido utilizando la misma temperatura y condiciones de crecimiento. A continuación, caracterice las bacterias extrayendo el ADN bacteriano de cultivos líquidos puros amplificando el ARN ribosómico 16S utilizando 27 cebadores directos y 1495 inversos y realizando la PCR como se describe en el texto.
Cuando las muestras de fruta y compost recolectadas se distribuyeron en placas de Petri y se sumergieron en un medio líquido o viscoso, los gusanos abandonaron el material del sustrato y nadaron hacia la superficie del medio. Los microbios se aislaron como colonias individuales puras y la purificación jugó un papel esencial ya que algunas bacterias asociadas a C.elegans pueden formar biopelículas o agregarse fácilmente, lo que resulta en cultivos de múltiples especies. La PCR utilizando los cebadores específicos de C.elegans, a saber, NLP 30 hacia adelante y NLP 30 hacia atrás, dio como resultado la amplificación de un producto de 154 pares de bases para C.elegans.
El ADN aislado de gusanos individuales dio como resultado bandas de PCR débiles, mientras que la extracción de ADN de las poblaciones de gusanos que consistían en al menos 50 gusanos produjo una cantidad mayor y bandas más claras. El éxito de la PCR específica de C. elegans se confirmó mediante la ejecución del ADN de una cepa de laboratorio, a saber, N2, como control positivo simultáneamente con el ADN de los nematodos aislados Los microbios están en todas partes. Por lo tanto, es esencial trabajar en condiciones estériles para garantizar que los microbios que están aislados estén realmente asociados con el gusano en la naturaleza.
Los microbios aislados se pueden usar para estudiar las interacciones huésped-microbiota o el papel de los microbios en la biología del huésped, por ejemplo, el envejecimiento, el desarrollo o la inmunidad en experimentos de laboratorio controlados. Los microbios aislados con esta técnica son utilizados actualmente por la comunidad de C.elegans para mejorar la comprensión de la diversidad de la microbiota en la aptitud del huésped o el papel de los microbios en la inmunidad.
