Nuestros protocolos ayudan a crear ratones modificados genéticamente que requieren experimentos avanzados in vivo con ratones, como la visualización de la expresión génica, la humanización genética y la eliminación condicional de genes. La técnica de edición del genoma del cigoto de ratón presentada aquí permite la inducción altamente eficiente, rápida y simple de modificaciones genéticas avanzadas, como el knock-in de casete de genes y flox. Dado que los ratones modificados genéticamente se utilizan en diversos campos de investigación, como neurología, inmunología, metabolismo, reproducción y enfermedades infecciosas, nuestra tecnología presentada aquí es fundamentalmente compatible con este amplio campo de investigación.
Demostrando el procedimiento estarán Natsumi Iki, Miyuki Ishida y Yoko Tanimoto, personal técnico de mi laboratorio. Para comenzar, prepare dos placas de Petri de 35 milímetros para el cultivo de cigoto y colóquelas en la incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono hasta su uso. Recoja los oviductos y colóquelos en una gota de 20 microlitros de medio M2 que contenga 0,75 miligramos por mililitro de hialuronidasa en la tapa de la placa de Petri.
Use una pinza de punta fina para recoger un oviducto y perfundir unos 50 microlitros de medio M2 con hialuronidasa a través de las fimbrias. Después de 30 segundos, usando un capilar de vidrio, recoger cigotos morfológicamente normales con una pequeña cantidad de medio y lavarlos transfiriéndolos a gotas medianas M16 frescas. Luego, agrupe los cigotos lavados en una placa de Petri y repita el proceso hasta que se recuperen todos los cigotos.
Con el extractor de pipetas programable, tire de algunas pipetas de vidrio. Rompa la punta de la aguja de microinyección golpeando la bola de vidrio unida a la punta de microforja. Compruebe el tamaño de la punta bajo un microscopio con un aumento de 1.000x y asegúrese de que el tamaño de la punta de la aguja de microinyección sea de alrededor de un micrómetro de diámetro.
Use una microforja para doblar la aguja de microinyección a unos dos o tres milímetros de la punta. Inyecte de 1 a 1,5 centímetros del líquido de operación en el centro de la aguja de microinyección y conéctelo al soporte del microinyector manual con el actuador piezoeléctrico. A continuación, conecte la aguja de sujeción al soporte del microinyector manual opuesto y mueva el líquido de operación a la punta de la aguja de microinyección con presión gradual.
Fije los soportes del microinyector manual en el micromanipulador. Prepare una cámara de inyección con tres gotas. Primero, con 10 microlitros de medio M2, segundo, con cinco microlitros de polivinilpirrolidona al 12% en medio M2, y tercero, con cinco microlitros mezcla de crRNA, tracrRNA, proteína Cas9 y la solución de ADN del donante.
Cubra las gotitas con aceite mineral y coloque la cámara de inyección en la etapa de microscopio invertido. Bajo el microscopio invertido con un aumento de 50x, baje la pipeta de microinyección en la gota de PVP al 12%. Aspire y dispense 12% PVP para limpiar el interior de la punta de la aguja de microinyección y transferirla a la gota de RNPD.
Coloque el microinyector manual bajo presión negativa. Aspire la solución de RNPD en la aguja de microinyección y espere hasta que se aspire un volumen suficiente. Con un aumento de 50x, llene todo el interior de la aguja de microinyección con líquido.
Luego, detenga la ingesta y permita que la solución RNPD sea expulsada gradualmente ajustando el microinyector manual a presión positiva. Mueva la punta de la aguja de microinyección en el aceite. Coloque 50 cigotos en la gota M2 y baje suavemente la pipeta de retención en la misma gota.
Transfiera la aguja de microinyección a la gota M2 que contiene cigotos. Cambie a un objetivo de 20x y concéntrese en la punta de la pipeta de microinyección. Después de sostener un cigoto, concéntrese en el pronúcleo moviendo el micromanipulador.
Inserte la aguja de microinyección en el cigoto y acerque la punta al pronúcleo. Una vez que la punta llegue a la membrana del pronúcleo, aplique el pulso piezoeléctrico para perforar. Cuando la aguja de microinyección perfore el pronúcleo, inyecte la solución de RNPD y observe la hinchazón del pronúcleo.
Una vez que el pronúcleo esté completamente inflado, retire rápidamente la aguja y realice el mismo procedimiento en los pronúcleos femenino y masculino. Diferenciar los cigotos antes y después de la inyección moviendo el cigoto inyectado a otra ubicación dentro de la gota M2, y continuar inyectando todos los cigotos presentes en la gota M2. Después de la inyección, transfiera los cigotos a un plato fresco M16.
Seleccione los cigotos sobrevividos 10 minutos después de la inyección. Retire los cigotos lisados dañados por la inyección y distribuya los cigotos supervivientes a cada gota en el plato M16. Coloque una pequeña cantidad de medio de cultivo, algunas burbujas de aire como marcador y los cigotos en una pipeta para la transferencia.
Usando una microcizalla, haga una incisión entre la ampolla y las fimbrias del oviducto. Introducir los cigotos en la incisión y simultáneamente confirmar que se ha introducido la burbuja de aire. La mediana de eficiencia de producción de 13 ratones knock-in de casetes de genes independientes fue del 20,8%, con un máximo del 39,5% y un mínimo del 7,9%La mediana de la tasa de natalidad bajo esta condición no letal dirigida a genes fue del 34,0%, con un máximo del 43,3% y un mínimo del 15,9%. desconocido, la mediana de la tasa de natalidad fue del 30,2%, con un máximo del 43,8% y un mínimo del 17,3%El diámetro de la punta de la aguja de inyección no debe ser demasiado delgado, y la presión del inyector manual debe ajustarse para garantizar que la solución en la aguja se inyecte y que el pronúcleo se infle lentamente.
