La forma en que las células mantienen la homeostasis de las proteínas no se entiende bien en el contexto del estrés celular y la senescencia. En este protocolo, proporcionamos una forma simple y precisa de calcular el recambio de proteínas, que es un componente clave de la homeostasis de proteínas en células vivas. Pulse SILAC le da a un experimentador la capacidad de medir la renovación de proteínas para proteínas individuales y todo el proteoma de una manera de alto rendimiento que también es más auténtica para los sistemas biológicos que otros métodos.
Los principios de este método se pueden aplicar a cualquier sistema que pueda ser etiquetado metabólicamente, incluyendo organismos enteros. Este método también puede conducir a la comprensión de la senescencia celular, el envejecimiento y las enfermedades neurodegenerativas. El análisis de espectrometría de masas es altamente sensible a ciertos contaminantes químicos, como los detergentes.
Utilice reactivos de grado LC-MS durante todo este procedimiento para garantizar una recopilación de datos de alta calidad. Para comenzar el etiquetado metabólico de las células, reemplace los medios para tres placas cada una de células senescentes y quiescentes con 30 mililitros de medios de luz SILAC. Por separado, reemplace el medio para tres placas senescentes y tres inactivas con 30 mililitros de SILAC Heavy.
Cultive las células durante tres días sin cambiar el medio. Para separar las células de las placas de cultivo, agregue cinco mililitros de reactivo de tripsina precalentado a cada placa e incube las placas durante cinco minutos a 37 grados centígrados. Más tarde, resuspend las células separadas en cinco mililitros del mismo medio utilizado para el cultivo a un volumen total de 10 mililitros.
A continuación, transfiera las células al hielo y centrífuga las células a 300 veces G a cuatro grados centígrados. Después de lavar el pellet dos veces, gire las células nuevamente y retire el sobrenadante antes de volver a depositar el pellet en 150 microlitros de urea de ocho molares recién preparada y tampón de lisis de bicarbonato de amonio 50 milimolar. Mezcle el contenido del tubo mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo.
Alícuota 50 microgramos de la muestra de proteína en un nuevo tubo y lleva las muestras a volúmenes iguales con tampón de lisis. Luego agregue ditiotreitol a una concentración final de 20 milimolares al tubo e incube la muestra a 37 grados Celsius durante 30 minutos con agitación. Deje que la muestra se enfríe a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de agregar yodoacetamida a una concentración final de 40 milimolares e incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos.
Luego diluya la muestra por debajo de la urea de un molar con un tampón de bicarbonato de amonio de 50 milimolares. Agregue un microgramo de tripsina por 50 microgramos de proteína inicial o a 1:50 de la proporción de tripsina a proteína a la muestra. Incubar la muestra durante la noche a 37 grados centígrados con agitación para digerir las proteínas en péptidos.
Al día siguiente, agregue ácido fórmico al 1% por volumen de la muestra para calmar la digestión de la proteína. Para la limpieza de la muestra, coloque un cartucho de extracción en fase sólida en un colector de vacío, utilizando un cartucho de extracción para cada muestra, de acuerdo con las pautas del fabricante. Después de la extracción, retire las muestras de péptidos del colector de vacío y séquelas completamente en un concentrador de vacío.
El secado dura aproximadamente tres horas. Para la espectrometría de masas, o análisis de EM, resuspender la muestra peptídica a una concentración de 400 nanogramos por microlitro en un tampón de ácido fórmico al 0,2%. Para resolver los péptidos, mezcle la muestra durante cinco minutos.
Luego, sonicar durante cinco minutos en un sonicador de baño de agua. Luego, centrífuga la muestra para granular los materiales insolubles y transferir los sobrenadantes peptídicos a viales de EM. Envíe las muestras para el análisis proteómico mediante cromatografía líquida en tándem espectrometría de masas, o LC-MS-MS.
Utilice la configuración recomendada para el análisis no dirigido por la instalación de espectrometría de masas. Cargue las muestras en una columna analítica con un caudal de 400 nanolitros por minuto para eluir los péptidos a lo largo de un gradiente lineal de 90 minutos utilizando una mezcla de disolventes orgánicos e inorgánicos, con el disolvente orgánico que oscila entre el 5 y el 35%Adquirir datos de espectrometría de masas en el modo dependiente de datos, con un ciclo continuo de escaneos de encuesta MS1 seguido de 20 escaneos MS2 dependientes de datos con fragmentación HCD. Cuantifique las áreas de pico de péptidos para péptidos pesados y ligeros en la herramienta de software Proteome Quantitation.
Luego, exporte las áreas pico de péptidos pesados y ligeros. Para el cálculo de las vidas medias de las proteínas, abra el Libro de trabajo de análisis SILAC en la primera hoja denominada Datos sin procesar y pegue los ID de UniProt, los nombres de los genes, las áreas pico pesadas y ligeras en las columnas indicadas. A continuación, abra la cuarta hoja denominada Análisis y quite las filas donde las columnas G y H indican que la muestra está fuera del rango y mantenga las filas que leen dentro del rango.
Los fenotipos senescentes se validaron mediante la actividad de la beta-galactosidasa asociada a la senescencia y el análisis RT-qPCR. Para la actividad de la beta-galactosidasa, las células senescentes parecían azules, mientras que las células de control inactivas no tenían o tenían un color mínimo. En el análisis RT-qPCR, las células senescentes mostraron mayores arronales de interleucina-6, CXCL8 y CDKN1A-P21 en comparación con las células inactivas.
Por el contrario, el nivel de lamina B1 que codifica para el marcador de proliferación fue bajo o ausente en las células senescentes. Los cromatogramas iónicos extraídos de péptidos revelaron la proporción relativa de señales peptídicas pesadas y ligeras. Una menor proporción de señales de péptidos pesados en relación con las células senescentes ligeras indicó una tasa de renovación de proteínas más lenta, y una señal de péptido pesado más alta en relación con la luz indicó una tasa de renovación de proteínas más rápida.
Las muestras no etiquetadas mostraron poca o ninguna señal peptídica pesada. Se calcularon las vidas medias de 695 proteínas identificadas a partir del análisis de espectrometría de masas. La vida media se informa como una relación log-dos de células senescentes sobre células inactivas y se traza en una gráfica de volcán.
Tras el cálculo de las tasas de renovación de proteínas en células senescentes, el análisis posterior puede revelar vías biológicas candidatas que están reguladas por mecanismos de proteostasis. Pulse SILAC allanó el camino para que los investigadores estudiaran la dinámica de las proteínas con una granularidad y un rendimiento sin precedentes, lo que nos permitió estudiar los cambios en la homeostasis de las proteínas en muchas proteínas individuales.
