Este método proporciona nueva información sobre cómo producir en masa conidios infecciosos de hongos entomopatógenos para controlar importantes plagas de insectos en agroecosistemas comerciales, dada la situación actual en la que la mayoría de los insecticidas se eliminan gradualmente debido a las preocupaciones de su efecto tóxico sobre el medio ambiente y la salud humana. La técnica describe el método utilizado para garantizar el rendimiento óptimo de los conidios de EPF durante la producción en masa. El método es útil para el manejo integrado de plagas y el control biológico al proporcionar información sobre la efectividad de los conidios producidos en masa para el manejo a gran escala de plagas dañinas de insectos resistentes a los insecticidas en los agroecosistemas.
Este procedimiento fue desarrollado y demostrado por la Dra. Letodi Luki Mathulwe, la Dra. Nomakholwa Faith Stokwe y la profesora Antoinette Paula Malan. Calentar un litro de agua destilada y apagar el fuego antes de llegar al punto de ebullición. Ahora, agregue 30 gramos de glucosa, cuatro gramos de fosfato de potasio dibásico, 20 gramos de extracto de levadura, 15 mililitros de licor de maíz empinado y lleve el contenido a un hervor suave durante dos o tres minutos.
Vierta un total de 100 mililitros del medio en nueve matraces diferentes de 250 mililitros. Coloque un tapón de algodón en cada matraz y cubra el algodón con papel de aluminio como tapón. Autoclave el medio en los matraces durante 55 minutos a 121 grados centígrados.
Más tarde, deje que el medio en los matraces se enfríe y agregue 10 miligramos por mililitro de estreptomicina al medio en cada matraz. Recolectar de dos a tres bucles bacterianos de conidios fúngicos de placas de cultivo de hongos de dos a tres semanas de edad para ambos aislados de EPF. Transfiera los conidios fúngicos a cada 100 mililitros de medios líquidos en los matraces de 250 mililitros en condiciones estériles y selle los matraces.
Incubar los matraces de cultivo líquido a aproximadamente 25 grados Celsius en un agitador orbital a 140 RPM durante tres días y cesar la incubación una vez que los cultivos muestren signos de alta turbidez con crecimiento de blastosporas fúngicas. Para detectar cualquier posible contaminación bacteriana de los cultivos, extraiga una muestra de 100 microlitros de cada matraz de cultivo líquido después de 24 horas de incubación y placa en tres placas SDA por aislado. Incubar las placas durante 48 horas a una temperatura controlada de más o menos 25 grados centígrados.
Use una pequeña tubería de desecho de cloruro de polivinilo para crear un cuello para la bolsa de fermentación en el extremo abierto de la bolsa de autoclave y use cinta de autoclave para asegurar la tubería. Cierre la tubería con un tapón de algodón estéril para permitir un intercambio de gases suficiente durante la fermentación. Use arroz blanco de grano largo hervido como medio de sustrato sólido para las blastosporas de Metarhizium pinghaense y Metarhizium robertsii.
Para cada bolsa de fermentación, agregue un kilogramo de arroz y 300 mililitros de agua destilada estéril. Mezcle suavemente el contenido de las bolsas de fermentación. Colóquelos en bolsas exteriores para autoclaves en posición vertical y en autoclave a 121 grados centígrados durante 55 minutos.
Después del autoclave, deje que los sustratos se enfríen durante unos 45 minutos en condiciones estériles. Retire el cierre de cada uno de los matraces de cultivo líquido de Metarhizium pinghaense y Metarhizium robertsii bajo un flujo laminar y encienda el borde de cada matraz durante 10 segundos. Vierta 100 mililitros de cultivos líquidos en las bolsas de fermentación retirando los tapones de algodón de sus cuellos.
Vuelva a colocar los tapones de algodón y cubra la parte superior del cuello de la bolsa con papel quirúrgico asegurado con una banda elástica. Gire la parte superior de la bolsa y mezcle el contenido de la bolsa agitando y manipulando el sustrato mediante masaje. Incubar las bolsas a unos 25 grados centígrados aplanando el sustrato en las bolsas para evitar la formación de lechos gruesos.
Dos o tres días después de la inoculación y la incubación, cuando se haya producido un crecimiento micelial visible y la unión del sustrato por el hongo, rompa el sustrato en las bolsas de fermentación masajeando el contenido de las bolsas. Después de la fermentación, transfiera los cultivos esporulados a bolsas de papel marrón de 26 a 30 kilogramos y seque los cultivos de hongos durante 10 a 12 días antes de su uso en ensayos. Para mejorar la resistencia a la tracción de las bolsas de papel, corte horizontalmente 1/3 de la parte superior de la bolsa y forre la parte inferior de la bolsa.
Desmenuza suavemente el sustrato en cada bolsa de fermentación. Corte la esquina de cada bolsa y transfiera lentamente todo el cultivo a las bolsas de papel a través del espacio dejado por la esquina cortada. Etiquete cada bolsa de papel, doble sobre el extremo superior de cada bolsa dos veces y cierre con grapas para crear una estructura triangular de carpa.
Coloque las bolsas en las rejillas de secado de alambre para permitir un secado adecuado y uniforme a una temperatura controlada de aproximadamente 25 grados centígrados y una humedad baja de 30 a 40% Cosechar conidios fúngicos de los cultivos utilizando tres tamices anidados montados en una bandeja de recolección. Cargue lentamente la muestra de cultivo seco en la malla ETS número 35 y tamiz. Coloque una tapa en el tamiz para evitar la liberación de conidios fúngicos en el aire.
Agregue de 10 a 12 canicas de vidrio a los tamices para ayudar al paso de los conidios fúngicos a través de las pantallas de malla y evitar la retención de los conidios en el tamiz, lo que puede resultar en una reducción de la recuperación de esporas. Tape y selle las juntas del tamiz con cinta adhesiva eléctrica. Coloque los tamices en un agitador vibratorio equipado con una almohadilla adhesiva para asegurar la bandeja de recolección y los tamices durante 20 a 25 minutos a un movimiento de 560 a 640 vibraciones por minuto.
Retire los tamices de prueba de la bandeja de recolección, recoja los conidios y guarde los conidios recolectados en bolsas herméticas e impermeables al agua con cierre de cremallera para su almacenamiento a largo plazo. Se cosechó un promedio de aproximadamente 1,83 gramos de Conidios secos de Metarhizium robertsii del sustrato de cebada en escamas, mientras que no se cosechó cero Metarhizium pinghaense del sustrato. No se cosecharon conidios fúngicos secos del sustrato de avena en escamas para ninguna de las especies de Metarhizium.
Se observó una diferencia significativa entre las dos especies de Metarhizium en el promedio estimado de conidios por gramo cosechado de los granos de arroz. Metarhizium robertsii tuvo un recuento promedio de conidios por gramo ligeramente más alto que Metarhizium pinghaense. No se observaron diferencias significativas entre las dos especies de Metarhizium en el número estimado de conidios presentes en el sustrato de arroz gastado.
Sin embargo, Metarhizium pinghaense tuvo conidios ligeramente más altos en el sustrato de arroz que Metarhizium robertsii No se estiman diferencias significativas en las dos especies de Metarhizium en su rendimiento total de conidios obtenidos de los cultivos de sustrato de arroz. Sin embargo, Metarhizium pinghaense produjo un rendimiento de conidios ligeramente mayor que Metarhizium robertsii, que produjo un rendimiento conidial más bajo. La parte desafiante de esta técnica es la contaminación del sustrato a través de la inoculación con un inóculo de blastosporas contaminado.
Por lo tanto, siempre asegure la esterilidad mientras trabaja. Esta demostración ayuda a los estudiantes a reproducir eficientemente la técnica sin errores torpes que pueden resultar en la terminación de todo el proceso.
