Mi nombre es Dr.Shankari Nair, y soy becario postdoctoral en la División de Biofísica de Radiación en el Departamento de Medicina Nuclear de NRF, iThemba LABS. En este video, demostraremos el uso de un ensayo automatizado de focos Gamma H2AX en linfocitos de sangre periférica humana para su uso en aplicaciones de simetría por lotes. Los riesgos de radiación para el personal están estrictamente controlados.
La radiación ionizante afecta directamente a la estructura del ADN al inducir roturas de ADN. Particularmente roturas de doble hebra. Uno de los primeros pasos en el proceso de reconocimiento de rotura de doble cadena de ADN es la fosfohorilización de la variante de histonas, H2AX, y el reclutamiento de proteínas de reparación.
Este video describirá el uso de la microscopía para calificar el número de focos gamma-H2AX ren-nucleus utilizando un sistema automatizado de escaneo de diapositivas y una plataforma de análisis, integrando el microscopio fluorescente. Los linfocitos se aíslan de la sangre total. Diluya la sangre entera con PBS en una proporción de uno a uno, luego coloque suavemente la sangre diluida en un volumen de medio de gradiente de densidad.
Gradualmente cubra la sangre manteniendo el tubo inclinado a 45 grados. Transfiera la suspensión a una centrífuga y gire a temperatura ambiente durante 20 minutos a 900 G.Después de la centrificación se formarán cuatro capas. Transfiera cuidadosamente la capa turbia que contiene los linfocitos a un nuevo tubo cónico estéril.
Lave los linfocitos con PBS y cuente con un hemocitómetro. Una vez que se determina el número total de linfocitos, diluya el linfocito y la suspensión a una concentración de aproximadamente 800, 000 linfocitos en un mililitro de RPMI completo. Las muestras ya están listas para nuestra radiación.
Los linfocitos se irradian con rayos gamma de una fuente de cobalto 60, y luego se incuban durante una hora a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada de dióxido de carbono al 5%. Para cada condición de irradiación o tubo, se preparan tres diapositivas. Coloque la diapositiva en el soporte del clip, seguida de la tarjeta de filtro y, finalmente, el embudo.
Asegure los clips deslizantes y colóquelos en la citocentrífuga. Agregue 250 microlitros de la suspensión celular en cada embudo y gire durante 30 G durante cinco minutos. El uso de la citocentrífuga es esencial para obtener condiciones estandarizadas en la automatización de las diapositivas.
Una vez hiladas, retire las diapositivas del clip y luego, con la pluma hidrofóbica, dibuje un círculo alrededor del lugar donde están las células. Ahora que se han hecho las diapositivas, las células deben fijarse a la diapositiva para que pueda ocurrir la tinción inmunofluorescente. Las células se fijan utilizando un paraformaldehído al 3%, o PFA, y una solución de PBS durante 20 minutos.
Después de la fijación, lave las diapositivas en un frasco de Coplin con PBS durante cinco minutos. Luego, cubra las células con Tritón X para permitir la permeabilización. El paso de permeabilización elimina más lípidos de la membrana celular para permitir que los anticuerpos entren en el núcleo celular.
A partir de aquí, utilizamos una solución de bloqueo hecha de 1% BSA en PBS, para lavar las diapositivas con el fin de reducir la posible unión no específica. Después de tres pasos de lavado de 10 minutos con 1% BSA y PBS, los portaobjetos se incuban a temperatura ambiente con uno a 500 anticuerpos primarios anti-gamma H2AX durante una hora en la cámara humidificadora, lo que se logra fácilmente agregando papel de seda húmedo en la base de la caja de almacenamiento de diapositivas rectangular. Después de la incubación con un anticuerpo primario, retire el líquido y lave los portaobjetos nuevamente en una solución de BSA al 1%.
Incubar portaobjetos con un anticuerpo TRITC secundario de burro diluido de uno a mil durante una hora en la cámara humidificadora. Retire el anticuerpo antes de realizar tres lavados de 10 minutos en PBS. Cubra el frasco de Coplin con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz durante los pasos de lavado.
Retire los portaobjetos y limpie el exceso de PBS fuera del círculo hidrofóbico con papel de seda sin polvo. Finalmente, agregue una o dos gotas de DAPI como resultado un medio de montaje de aquiescencia y cubra suavemente las diapositivas con el deslizamiento de la cubierta. Asegúrese de que no haya burbujas de aire atrapadas y luego almacene las muestras en un lugar oscuro a cuatro grados centígrados durante la noche.
Limpie suavemente las diapositivas con un 70% de etanol y coloque las diapositivas en la plataforma de escaneo automatizada, o etapa de diapositivas, conectada al microscopio ZED-2 de imágenes axiales de zite. Seleccione la configuración de clasificación en la pestaña MetaCyte para editar el clasificador. El clasificador seleccionado será utilizado por el sistema para escanear y puntuar las diapositivas, y se basa en un conjunto de parámetros predefinidos, que determinarán cómo el sistema selecciona las celdas y puntúa los focos.
El clasificador se puede optimizar y entrenar en función de una serie de campos de imagen preclasificados. Dependiendo de la ampliación del microscopio, el tipo de y los anticuerpos que se utilizan para la tinción, se puede optimizar un clasificador diferente. Por lo tanto, los clasificadores generalmente varían de un laboratorio a otro, pero daremos una visión general de los pasos más básicos que se deben tener en cuenta cuando se debe ajustar la configuración de un clasificador.
En la pestaña Capture', se puede encontrar el filtro que se utilizará, aquí DAPI y TRITC, con un tiempo máximo de integración de 1.04 segundos. Este último se basa en el clasificador original que fue proporcionado por la compañía y luego ajustado para la intensidad de anticuerpos y la señal gamma de fondo H2AX, o TRITC, en este tipo de célula específica, es decir, los linfocitos. En la pestaña Exposición, se define el tiempo mínimo de integración.
El clasificador siempre permanecerá dentro del tiempo mínimo y máximo de integración, lo que evita la sobreexposición o subexposición de la diapositiva. En la pestaña Selección de celdas, las áreas de objeto mínimas y máximas se definieron en función del tamaño y la forma de las celdas que se analizan. Por ejemplo, el valor de concavidad predeterminado y la relación de aspecto son específicos para los linfocitos, que generalmente tienen formas redondas.
En la pestaña Características, puede cambiar la galería y la vista de histograma, así como determinar lo que el microscopio necesita para puntuar. El sistema puede puntuar numerosos elementos, dependiendo de las características que el usuario haya seleccionado. Un ejemplo es el umbral de cómo el software puntúa los objetos individuales.
Una vez que se haya identificado un clasificador adecuado, seleccione la configuración en la barra lateral y asigne a cada diapositiva un nombre único, seguido de la selección del clasificador adecuado. Seleccione Recuento máximo de celdas y agregue el número máximo de celdas necesarias para ser escaneadas. La búsqueda finaliza incluso si la ventana de búsqueda seleccionada aún no se ha escaneado por completo, tan pronto como se alcanza el recuento máximo de celdas.
Para aplicaciones de biodisimetría, la puntuación automatizada de 1000 células por diapositiva es suficiente, teniendo en cuenta que se preparan tres diapositivas por muestra de sangre. Haga clic en Aceptar' para confirmar la configuración. Para escanear diapositivas, seleccione Buscar en la barra lateral.
Si se seleccionó la configuración "Ventana de búsqueda manual" en la configuración de la diapositiva, se abrirá un cuadro de diálogo una línea para determinar el área de escaneo. Mediante el uso del objetivo de 10 veces, el área de búsqueda rectangular en la diapositiva se selecciona de forma interactiva fijando dos esquinas del campo de búsqueda con el clic izquierdo del mouse. Esto se puede confirmar con el botón OK'.
Ajuste una posición de inicio de enfoque. El software solicitará un enfoque y centrará un núcleo de referencia utilizando el objetivo de 40 veces para cada diapositiva y confirmará la configuración con OK. El sistema se moverá automáticamente a todos los lados secuencialmente. Si es necesario, ajuste la configuración de live image y el tiempo de integración para este paso.
Compruebe todos los ajustes del microscopio. Asegúrese de que la palanca del tubo del microscopio esté en una posición que desvíe toda la luz a la cámara y confirme el aviso del sistema con OK. El sistema inicia el enfoque automático de la cuadrícula en la posición de la cuadrícula más cercana al campo de referencia. Continúa enfocando el campo en la cuadrícula regular, moviéndose en un meandro hacia la parte delantera y trasera de la ventana de búsqueda.
El escaneo comienza cuando se completa el enfoque automático de la cuadrícula. La etapa se mueve en un patrón de meandro campo tras campo para capturar datos. Cuando se detecta una celda, se coloca y la imagen de la galería se almacena y se muestra en la pantalla y se actualiza el recuento de celdas.
La búsqueda finaliza si se ha analizado toda la búsqueda, si se ha alcanzado el número máximo de celdas o si se ha cancelado la búsqueda. Cuando se complete el escaneo, haga clic derecho en la barra en la parte inferior y abra una muestra. Revise la galería, que consta de pequeñas imágenes de las células detectadas.
En esta ventana se pueden especificar las celdas almacenadas en la galería mediante criterio a elegir en el menú desplegable. Las celdas generalmente se muestran en el orden en que se han detectado. Haga clic en Histograma de calidad o Diagrama de valores de características para obtener la distribución de las células detectadas, así como las medias y la desviación estándar de los focos puntuados.
Aquí comparamos las muestras de gris cero versus 1.5 grises. Esto es típicamente una diapositiva de control, con un valor medio de 0.124 focos por célula, donde la célula no ha sido irradiada. En un contexto de biodisimetría, esto indicaría que una persona no ha estado expuesta a una dosis alta de radiación.
En el gráfico, podemos ver que la mayoría de las células tienen casi cero focos por célula, y no hay un lado de la distribución normal. Cuando comparamos esto con una dosis de 1.5 gris, se puede ver claramente que se trata de una muestra irradiada. En un contexto de biodisimetría, esta distribución normal es una clara señal de que la muestra ha sido expuesta a la radiación.
El escaneo automatizado es lo suficientemente sensible como para detectar focos inducidos a dosis bajas. Los resultados muestran un claro aumento lineal del número de focos por célula con dosis. El método automatizado de detección de rotura de doble cadena de ADN es útil para aplicaciones de disimetría biológica rápidas y de alto rendimiento.
Gracias por verlo.
