Este método le permite cultivar bacterias en un ambiente que desencadena una fisiología celular y una morfología de biopelículas similares a la que se ve en las infecciones pulmonares por fibrosis quística. Los pulmones son un producto de desecho en la industria cárnica, por lo que no hay preocupaciones éticas. El modelo ofrece una plataforma para imitar la infección humana sin la necesidad de un modelo de animal vivo.
Esta técnica ofrece a los investigadores una nueva forma de examinar los fármacos candidatos para detectar el potencial de entrar y destruir las biopelículas que se forman en los pulmones de fibrosis quística. Con un mayor desarrollo y validación, creemos que el modelo EVPR podría tener un uso potencial para las pruebas de susceptibilidad a los antibióticos especializadas e individualizadas. Obtenga los pulmones inmediatamente después del sacrificio y transportarlos al laboratorio en una caja fría doméstica.
Trabajar sobre una superficie esterilizada y bajo una llama. Coloque los pulmones en una tabla de cortar de plástico limpio cubierta con papel de aluminio en autoclave y verifique que los bronquiolos permanezcan intactos. Los pulmones no son adecuados para su uso si ha habido algún daño en el matadero o durante el transporte.
Caliente un cuchillo de paleta bajo una llama y toque muy brevemente el cuchillo en el área del pulmón que rodea el bronquiolo para esterilizar la superficie del tejido. Corte el tejido superficial que rodea el bronquiolo usando una cuchilla de afeitar montada estérilmente, haciendo incisiones paralelas al bronquiolo para prevenir cualquier daño. Una vez que el bronquiolo ha sido expuesto, haga visible una incisión transversal a través del bronquiolo en el punto más alto.
Usando fórceps estériles, sostenga ligeramente el extremo libre del bronquiolo y corte cualquier tejido no deseado restante usando una cuchilla de afeitar montada estérilmente. Haga una incisión transversal final a través del bronquiolo antes de que cualquier ramificación sea visible para eliminar el bronquiolo de los pulmones. Coloque el bronquiolo en el primer lavado DMEM RPMI 1640.
Déjelo en el lavado y coseche secciones adicionales de bronquiolo del mismo pulmón para producir suficientes secciones de tejido para el experimento planificado. Coloque cualquier sección bronquiolar adicional del mismo pulmón en el lavado y déjelas en el lavado durante al menos dos minutos. Retire los bronquiolos del primer lavado y coloque las muestras en una placa de Petri estéril.
Sostenga ligeramente cada bronquiolo con fórceps estériles, teniendo cuidado de no dañar el tejido. Retire tanto tejido blando restante como sea posible y corte el tejido en tiras de cinco milímetros de ancho usando tijeras de disección estériles. Coloque todas las tiras de tejido bronquiolar en el segundo lavado DMEM RPMI 1640.
Déjelos en el lavado durante al menos dos minutos, luego retire las tiras de tejido del segundo lavado con fórceps estériles y colótelas en una placa de Petri limpia y estéril. Retire cualquier tejido blando restante unido al bronquiolo y corte las tiras en cuadrados usando tijeras de disección estériles. Agregue el tercer lavado DMEM RPMI 1640 en la placa de Petri y mezcle ligeramente las piezas de tejido en el lavado arremolinándose en la placa.
Vierta el tercer lavado de la placa de Petri sin quitar las piezas de tejido. Luego agregue el lavado scfm final, asegurándose de que todas las piezas de tejido estén cubiertas. Esterilice el tejido en SCFM bajo luz UV durante cinco minutos.
Use fórceps estériles para transferir cada pieza de tejido bronquiolar esterilizado a pocillos individuales de una placa de 24 pocillos que contiene almohadillas de agarosa SCFM. Para infectar cada pieza de tejido con la cepa bacteriana deseada, toque una colonia cultivada en una placa de agar con la punta de una aguja de calibre 29 unida a una jeringa de insulina estéril de 0.5 mililitros, luego toque la colonia sobre la pieza de tejido, pinchando suavemente la superficie. Para los controles no infectados, pinche suavemente la superficie de la pieza de tejido con la punta de la aguja, luego use una pipeta para agregar 500 microlitros de SCFM a cada pozo.
Esterilice una membrana de sellado transpirable para cada placa de 24 pozos bajo luz ultravioleta durante 10 minutos. Retire la tapa de la placa de 24 pozos y reemplácela con la membrana transpirable, luego incube las placas a 37 grados Celsius sin agitar. Configure conjuntos de piezas pulmonares replicadas de al menos dos pulmones independientes, utilizando un conjunto para un control negativo y un conjunto por cada concentración de antibiótico que se va a probar.
Después de 48 horas de incubación, inspeccione visualmente las piezas de tejido no infectadas para detectar el crecimiento de bacterias endógenas, lo que causaría que el medio alrededor de estas secciones sea turbio. Si se observa un crecimiento típico de la especie de estudio seleccionada, reinicie el experimento con pulmones frescos. Si las secciones de tejido no infectado no muestran ningún crecimiento bacteriano o el crecimiento mínimo, prepare una placa de lavado de 24 pozos y una placa de tratamiento de 24 pozos.
Cada pozo de la placa de tratamiento debe contener 500 microlitros de SCFM fresco sin antibióticos, o con el antibiótico de interés. Retire cada pieza de tejido infectada de la placa de incubación con fórceps esterilizados por llama. Remolino brevemente en un pozo fresco de la placa de lavado para eliminar cualquier célula bacteriana no asociada a la biopelícula y transferirla al pozo apropiado de la placa de tratamiento.
Selle la placa de tratamiento con una membrana transpirable fresca, luego incubarla a 37 grados Celsius sin agitar durante 18 a 24 horas. Use pinzas esterilizadas por llama para extraer cada pieza pulmonar de la placa de 24 pocillos y colóquela en un tubo estéril de homogeneización de dos mililitros que contenga un mililitro de PBS y un gramo de perlas de metal. Bead batió durante 40 segundos a cuatro metros por segundo.
Diluya en serie el homogeneato pulmonar usando PBS, y plató en agar LB para determinar las unidades formadores de colonias en piezas de tejido individuales, no tratadas y tratadas con antibióticos. Cuando se cultivan en el pulmón de cerdo ex vivo o EVPL, las biopelículas de P.aeruginosa y S.aureus demuestran una mayor tolerancia a los antibióticos en comparación con la susceptibilidad en los ensayos estándar de MIC y disco de caldo aprobados por la industria utilizando medios estándar. Los diversos efectos de diversos antibióticos sobre un biofilm EVPL-establecido son distinguibles.
Por ejemplo, la muerte por P.aeruginosa se logra en EVPL con 4 a 16X MIC ciprofloxacina, pero no con 4 a 8X MIC cloranfenicol. Las poblaciones de S.aureus que son susceptibles al linezolid en el análisis del disco pueden sobrevivir concentraciones del blanco-suero y más altas en EVPL. Incluso un ensayo in vitro optimizado no puede predecir con precisión la susceptibilidad de P.aeruginosa a la colistina en la EVPL.
La cantidad de antibiótico necesaria para lograr la muerte de tres log 10 de bacterias cultivadas con EVPL es a menudo significativamente mayor que el MIC o el MBEC calculado a partir de ensayos in vitro estándar. Además de distinguir las diferencias entre los agentes antimicrobianos, este modelo puede resaltar los cambios en la susceptibilidad en diferentes etapas de crecimiento bacteriano y para diferentes intervalos de dosificación de antibióticos. La creciente tolerancia de las biopelículas de P.aeruginosa a meropenem a medida que maduran se muestra aquí.
La supervivencia de S.aureus se midió a las 4 y 24 horas después de la exposición a flucloxacilina, lo que permite observar diferencias en la reducción de los recuentos celulares bacterianos a través del tiempo y entre los aislados. Las variaciones en la carga bacteriana a menudo aumentan con los tiempos de cultivo prolongados. Esto se puede ver en el control no tratado después del desarrollo de 48 horas del biofilm y de una exposición adicional de 24 horas para explicar el intervalo de dosificación antibiótico.
Es crucial mantener una excelente técnica estéril durante toda la disección, por lo que recomendamos hacer la disección en un laboratorio o en un área de su laboratorio que nunca se utiliza para el trabajo de microbiología. Recientemente utilizamos el modelo para explorar la entrada de colistina en el biofilm, y el modelo tiene un buen potencial para su uso en la investigación para mejorar la administración de fármacos en biopelículas.
