Nuestro protocolo descubre marcadores epigenéticos para el desarrollo de plantas de sorgo y resistencia a la sequía. Esta comprensión molecular ayudará a desarrollar mejores soluciones para adaptar los cultivos para climas extremos en el futuro. Este protocolo genera histonas de alta pureza a partir de tejido de hoja de sorgo adecuado para la elaboración de perfiles no dirigidos de modificaciones post-traslacionales por espectrometría de masas.
Demostrando el procedimiento estarán Shadan Abdali y Tanya Winkler, asociados de investigación post-licenciatura de EMSL. Para empezar, moler algunas hojas de sorgo con nitrógeno líquido y almacenarlas en un tubo centrífugo de 50 mililitros a menos 80 grados Celsius. Utilice aproximadamente cuatro gramos de polvo de hoja para el análisis de histona de cada muestra.
Prepare los tampones de extracción 1, 2A y 2B como se describe en el manuscrito de texto y agregue una tableta inhibidora de la proteasa al búfer de extracción uno para hacer una concentración final de 0,2X. A continuación, agregue 20 mililitros del tampón de extracción preparado uno al polvo de hoja molida y mezcle o vórtice suavemente durante 10 minutos. Usando malla 100, enjuague el material filtrado dos veces con dos mililitros de búfer de extracción uno cada vez.
A continuación, centrífuga el filtrado a 3.000 veces G durante 10 minutos a cuatro grados Centígrados en un rotor de cubo oscilante para peletizar los restos celulares y grandes orgánulos subcelulares. Simultáneamente, preparar el búfer de extracción 2A mediante la adición de inhibidor de la proteasa a una concentración final de 0.4X. Deseche el sobrenadante sin perturbar el pellet.
A continuación, resuspend el pellet en cinco mililitros del búfer de extracción preparado 2A. Incubarlo sobre hielo durante 10 minutos con una mezcla suave. Centrífuga la solución a 2.100 veces G durante 15 minutos a cuatro grados Centígrados en un rotor de cubo oscilante para peletizar los escombros y núcleos.
Decantar el sobrenadante cuidadosamente sin perturbar el pellet. Prepare el búfer de extracción 2B añadiendo los inhibidores de la proteasa a una concentración final de 1X. Añadir cinco mililitros de este amortiguador preparado al pellet obtenido después de la centrifugación.
Centrífuga a 2.100 veces G durante 15 minutos a cuatro grados Celsius en el rotor del cubo oscilante a los restos de pellets y núcleos. Simultáneamente, prepare el búfer de lisis de núcleos añadiendo un comprimido inhibidor de la proteasa. Decantar cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el pellet y resuspend el pellet en 250 microlitros del tampón de lisis.
Vórtice la solución durante 15 segundos a máxima velocidad para homogeneizarla y volver a usar el material. Luego sonicarlo durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y guardarlo a menos 80 grados centígrados. Descongelar la muestra de núcleos congelados y añadir 750 microlitros de 5% buffer de guanidina.
Luego sonicarlo durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera la muestra a un tubo de dos mililitros y gírala a 10.000 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Simultáneamente, prepare una columna de cromatografía de intercambio de iones enjuagando con dos mililitros de acetonitrilo y cuatro mililitros de agua para minimizar la contaminación en la superficie.
Cargue aproximadamente de 200 a 300 microlitros de resina de intercambio de catión débil en la columna de cromatografía y deje que la resina se asiente. Lave la resina cuatro veces con tampón de guanidina y coloque el tubo y la columna sobre hielo. Coloque la columna en un tubo de recolección de dos mililitros y cargue el sobrenadante de la muestra preparada lentamente en el lecho de resina sin interrumpir la resina.
A medida que la solución fluye a través, cargue el eluent de nuevo a la parte superior de la columna de seis a ocho veces para permitir la máxima unión a la resina. A continuación, cargue dos mililitros de 5% tampón de guanidina para lavar las proteínas no histonas de la columna. Elute las proteínas de histona con un mililitro de 5% tampón de guanidina y recoger el eluent.
Limpie un filtro de espín de corte de tres kilodalton con 500 microlitros de disolvente de lavado, luego desalte el eluent restante usando el filtro de espín prelimpiado. Se observaron importantes proteínas de histona en regiones específicas del mapa de entidades LC-MS que indicaban el éxito del experimento. Este mapa representativo muestra histonas intactas de cuerpo entero en cajas discontinuas.
El mapa de características LC-MS de proteoformas H2B y H2A de 16 kilodalton muestra que ambos tienen múltiples homólogos con secuencias similares como se indica en los números únicos de la sesión del producto. Otro grupo de histonas H2A sin las colas extendidas se puede ver. La acetilación N-terminal, acetilaciones de lisina adicionales y oxidaciones de metionina en proteínas de histona H4 se pueden observar examinando las diferencias de masa en el mapa de entidades LC-MS que se muestra aquí.
Se identificaron dos secuencias de proteínas para las proteínas de histona H3, H3.3 y H3.2. La fragmentación de la disociación de transferencia de electrones se utilizó para generar el espectro de fragmentación del proteoforme H3.2 identificado. Los iones precursores y los espectros ms1 anteriores y siguientes se muestran aquí con sus picos de isótopo emparejados resaltados en púrpura.
Las modificaciones post-traslacionales se pueden localizar mediante el mapa de cobertura de secuencia. Al comparar la abundancia relativa de los proteoformes, se descubrieron cambios de proteoformas de piedra histone truncadas específicos de las condiciones de la muestra. El truncamiento C-terminal de H4 se observó sólo en las semanas tres y nueve para algunas de las muestras.
Para H3.2, los proteoformes truncados de N-terminal fueron generalmente más abundantes en la semana 10. Por el contrario, la terminal C truncó el H3.2 en puntos de tiempo anteriores. Los proteoformas truncados de terminales C H4 eran significativamente más abundantes en BTx642 que en RTx430.
Al intentar este protocolo, preste mucha atención a los colores del sobrenadante y el pellet. El cambio de color ayuda a identificar posibles problemas en la molienda o lisis del cloroplasto. Esperamos que este sólido protocolo para el aislamiento de histonas de las hojas de sorgo permita la investigación epigenética para otras plantas similares.
