Aquí presentamos protocolos para el cultivo de células óseas dentro de una plataforma adaptable de laboratorio en un chip. Estas técnicas se pueden utilizar para promover nuestra comprensión de los mecanismos que regulan la remodelación ósea inducida mecánicamente. Nuestro sistema permite el cultivo a largo plazo de células óseas, lo que permite la cuantificación directa de la formación ósea y la resorción en respuesta a entornos de carga mecánica alterados.
El uso de estas técnicas fundamentales puede conducir a descubrimientos que se extienden a una serie de problemas relacionados con los huesos como osteoporosis, cicatrización de fracturas y osteolisis periprotésica. Para crear la capa de pozo y microcanal, combine el prepolímero PDMS y el agente de curado en una proporción de 10 a uno en una taza de plástico y mezcle vigorosamente, luego desgaste el polímero durante 30 minutos. Vierta lentamente la mezcla sobre la mascarilla prenivelada apropiada.
Dejar reposar durante 30 minutos y hornearlo a 45 grados Centígrados durante 18 horas. Afloje los bordes del PDMS con una espátula de laboratorio cónica y quítela cuidadosamente lejos de la máscara, luego corte las virutas individuales con un bisturí y una plantilla impresa en 3D y límpielas con cinta adhesiva. Para crear la capa de membrana PDMS, repita los pasos anteriores para mezclar, verter y hornear pdms.
Retire la hoja PDMS de la caja de nivelación y corte membranas individuales que coincidan con las dimensiones de la capa de pozo y microcanal. Utilice pinzas para medir el espesor de la membrana en el centro y deseche las membranas que estén fuera del espesor deseado, luego limpie cuidadosamente las membranas con cinta adhesiva y colóquelas en un pedazo de película de parafina. Para crear la capa de tapa de PDMS, repita los pasos anteriores para mezclar, verter y hornear PDMS.
Después de cortar las tapas individuales a medida, golpee los orificios de acceso a través del PDMS con un punzón de biopsia de un milímetro y luego límpielos con cinta adhesiva. Active las superficies de las capas uno y dos con un limpiador de plasma durante 30 segundos en un ajuste de potencia de radiofrecuencia media, luego alinee los orificios de acceso en la capa uno con los microcanales de la capa dos y presione firmemente las dos capas juntas. Para el diseño de pozo profundo, repita este proceso con las capas dos y tres utilizando cinta adhesiva de doble cara para unir la película de parafina de la capa tres a una superficie plana durante el tratamiento de plasma.
Recorte el exceso de material de la membrana PDMS y retire cuidadosamente la hoja de película de parafina de la parte inferior del chip. Hornee el chip a 65 grados Centígrados durante 10 minutos para aumentar la fuerza de unión entre las capas de PDMS, luego inserte las puntas de dosificación de ángulo en los orificios de acceso en la tapa y asegúrelas con un epoxi de dos partes usando una punta de micropipeta para aplicar el epoxi alrededor de cada punta. Después de que el epoxi se haya curado por completo, limpie la superficie con 70% de etanol y transfiéralo a un gabinete de bioseguridad.
Conecte una jeringa de cinco mililitros a las puntas dosificadoras con tubos de silicona estériles y llene todo el chip con 70% de etanol durante al menos 30 segundos. Retire el etanol del chip y elrifielo con luz UV durante la noche. Al día siguiente, lave el chip tres veces con agua destilada, llénela con agua y retire el tubo de las puntas de dosificación.
Incubar el chip durante al menos 48 horas a 37 grados centígrados. Coloque un muelle de compresión alrededor del eje de la platina e insértelo en el orificio central en la parte inferior de la base, luego conecte el bloque de marcado a la parte inferior de la base con cuatro tornillos autorroscantes. Coloque un segundo resorte de compresión alrededor del tornillo central.
Inserte el tornillo en el orificio en forma hexagonal en la parte inferior de la esfera y atornille el ensamblaje en el orificio roscado en el centro del bloque de marcado. Atornille cuatro separadores macho-hembra en la parte inferior de la base. Retire la holgura del dispositivo girando el dial en sentido contrario a las agujas del reloj hasta que la parte superior de la platina esté por debajo de la parte superior de la base, luego gire lentamente el dial en el sentido de las agujas del reloj hasta que la parte superior de la platina esté nivelada con la parte superior de la base.
Utilice una jeringa de cinco mililitros para eliminar el agua del chip del pozo profundo y recubrir la parte inferior del pozo con 200 microlitros de colágeno tipo I en ácido acético durante una hora. Enjuague el chip tres veces con DPBS con calcio y magnesio y colóquelo en el soporte de viruta. Siembra el chip con osteocitos MLO-Y4 en medio alfa MEM complementado con suero de ternera, FBS y penicilina/estreptomicina.
Retire el tubo de las puntas de dosificación, coloque el chip en un plato de cultivo de pozo profundo e incubar las células a 37 grados centígrados y cinco por ciento de dióxido de carbono durante 72 horas. Después de la incubación, coloque el tubo estéril en las puntas dosificadoras y utilice una jeringa de cinco mililitros para eliminar el medio de cultivo gastado del chip, luego rellene lentamente el chip con un medio fresco. Coloque el soporte de viruta en la inserción rectangular en la parte superior de la base del dispositivo de carga, alimente el tubo a través de las ranuras situadas en la tapa y fije la tapa a la base.
Aplique la carga a las celdas girando el dial en el sentido de las agujas del reloj hasta que se alcance el desplazamiento de la platina deseado, luego coloque el dispositivo de carga en una caja de punta de micropipeta P1000 vacía e incubar las celdas con la carga durante 15 minutos. Después de la incubación, retire la carga de las celdas girando el dial en sentido contrario a las agujas del reloj hasta la posición inicial original, luego retire la tapa del dispositivo, coloque el soporte de viruta en la placa de cultivo del pozo profundo e incubar las células durante un período de recuperación posterior a la carga de 90 minutos. Utilice una jeringa de cinco mililitros para extraer el medio acondicionado del chip y retirar el chip del soporte de la viruta, luego utilice una espátula cónica para romper la unión entre la tapa del PDMS y la capa del pozo.
Las celdas ya están listas para ser analizadas. La configuración de pozos poco profundos se puede utilizar para analizar la actividad funcional de osteoblastos y osteoclastos. La formación ósea a partir de preosteoblastos se cuantificó utilizando manchas de color rojo alizarin y von Kossa.
La resorción ósea de osteoclastos se cuantificó utilizando tinción azul de toluidina y se utilizó una microscopía electrónica de barrido para verificar la presencia de fosas de resorción. La configuración de viruta de pozo profundo se utilizó para inducir la mecanotransducción de osteocitos estirando las células a través de una distensión estática fuera del plano. Las imágenes de semillas de osteocito en virutas demuestran que la incubación de 48 horas del chip con agua destilada es fundamental para mantener la viabilidad celular en la morfología típica.
Durante los episodios de carga, los osteocitos fueron expuestos a un gradiente de deformación unitaria inducido en la membrana PDMS. Se determinó la relación entre la tensión media equivalente y el desplazamiento de la platina para los valores entre uno y dos milímetros y se generó un mapa de calor representativo de la cepa inducida. Tras la carga, se analizó la viabilidad celular con la tinción de lactato deshidrogenasa y el ensayo de células muertas y V anexa.
La tinción de lactato deshidrogenasa de osteocitos estirados mostró una tinción más ligera cerca del borde exterior del pozo, que corresponde a la ubicación de valores de deformación unitaria más altos. Nuestra plataforma proporciona un alto grado de versatilidad y se puede utilizar para investigar una variedad de factores que regulan la remodelación ósea, como la mecanotransducción inducida por carga, la inflamación y los efectos de los medicamentos. Las técnicas presentadas aquí proporcionan una base para desarrollar un verdadero órgano óseo en un chip que podría mejorar en gran medida nuestra comprensión de las complejidades multicelulares que regulan la salud ósea.
