Las imágenes hiperespectrales permiten la adquisición de información espectroscópica en ubicaciones precisas dentro de una muestra. Por ejemplo, para la revelación de anisotropía óptica a un solo nivel de cristal. La generación de datos espectrales y espaciales de una muestra permite una investigación más detallada de la muestra de lo que es posible mediante espectroscopia o microscopía de fluorescencia sola.
Un gran número de parámetros ajustables que afectan a la resolución puede parecer abrumador al principio. Sin embargo, hacer una lista de verificación puede ayudar a familiarizarse con el sistema. Esta técnica requiere el ajuste manual del hardware de imágenes, así como la manipulación del software.
Es esencial ilustrar ambos aspectos visualmente para mostrar cómo ambos métodos se complementan entre sí. Demostrando el procedimiento con Nelson Rutajoga estará Emily Rodrigues, compañera post-doctora en mi laboratorio. Para configurar la configuración del imager para el mapeo de imágenes hiperespectrales, comenzando desde la etapa del microscopio y siguiendo la vía del haz de emisión hacia los detectores, deje la posición de un cubo óptico justo al lado del microscopio óptico vacante y coloque el cubo óptico del microscopio confocal en esa posición que dirija la emisión de la muestra a través de la trayectoria de luz visible.
Mirando a lo largo de la trayectoria óptica hacia el detector, coloque el cubo óptico visible que contiene el espejo dicroico y los filtros para dirigir la emisión visible a la ruta de detección en su posición. Continuando con el camino hacia el detector, coloque el cubo óptico de agujero confocal en la posición correcta para dirigir la luz a través de la ruta de detección de luz visible y siguiendo este camino, coloque el cubo óptico del espectrómetro confocal en la posición adecuada para que la luz emitida llegue al detector. Cuando todos los cubos estén en su lugar, ajuste manualmente la abertura de la hendidura del detector para que coincida con el tamaño del agujero seleccionado.
A continuación, en el software PHySpec, seleccione la apertura del agujero. Para el mapeo de imágenes hiperespectrales de terbium europium bi-pirimidina trifluoroacetililacetonato de un solo cristal, coloque manualmente el objetivo 20 veces del microscopio óptico debajo de la muestra y presione el botón blanco en el lado izquierdo del microscopio para encender la luz blanca. Gire la perilla debajo del botón para ajustar el brillo.
Ajuste la perilla delantera en el lado derecho del microscopio a R para enviar el 20% de la señal a la cámara y el 80% de la señal al detector. Pulse reproducir en la ventana de la cámara de color del software PHySpec para iniciar un escaneo en vivo. Si la ventana de la cámara de color muestra una imagen demasiado oscura o negra, aumente el tiempo de exposición y/o el valor de ganancia en la pestaña de la cámara de color.
Si la imagen es demasiado brillante, disminuya el tiempo de exposición y/o el valor de ganancia. Para centrarse en la muestra, gire las perillas del microscopio para ajustar la distancia entre el objetivo en el escenario y abra el obturador de la lámpara de banda ancha para permitir la excitación UV de la muestra. A continuación, gire la perilla de intensidad a la posición deseada para controlar la intensidad de la excitación de la lámpara de banda ancha.
Haga clic en Mostrar/Ocultar barra de escala para agregar una barra de escala a la imagen de microscopía óptica de campo brillante del cristal y observar una imagen del cristal bajo iluminación UV completa o confinada. Para seleccionar entre la iluminación confinada o una iluminación de campo ancho, utilice el stick y las perillas para ajustar el tamaño de la apertura del campo de la lámpara UV. En la pestaña SpectraPro SP 2300, seleccione una longitud de onda para observar la emisión de la muestra y ajuste el tiempo de exposición del detector.
Para obtener el cubo hiperespectral en el secuenciador, haga clic en más para agregar un nuevo nodo y haga clic en Confocal Imager. Haga clic en Adquisición multie espectro e introduzca los recuentos de posiciones X e Y deseados, así como el tamaño de paso deseado. Seleccione la opción de hardware para la sincronización de la cámara y para la asignación de emisiones visible, y haga clic en Aceptar.
En el secuenciador, haga clic en la línea de adquisición de varios espectros recién agregada para resaltar el nodo y haga clic en Reproducir para ejecutar el nodo seleccionado. Para el análisis de los datos de imágenes hiperespectrales capturados, por ejemplo, para una distribución espectral de una imagen, en el menú Procesamiento, seleccione Datos y Recortar y Doblar para aumentar la relación señal-ruido de la imagen. Para un perfil de intensidad de emisión, haga clic con el botón derecho en la imagen del cubo y seleccione Crear perfil X para el análisis de una línea.
Arrastre para seleccionar el área y haga clic con el botón derecho en la región de interés. Para seleccionar Agregar al gráfico. Para visualizar la intensidad de emisión en función de la posición física del objetivo.
El perfil de intensidad aparecerá en el nuevo gráfico. Para obtener un espectro de emisión de un área específica de la muestra, coloque el cursor sobre la imagen del cubo, haga clic con el botón derecho y haga clic en Selección de rectángulo. Arrastre y haga clic para dibujar la forma de selección sobre la región deseada.
A continuación, haga clic con el botón derecho en la región de interés y seleccione Agregar selección al gráfico. En la ventana Agregar al gráfico, seleccione Crear un nuevo gráfico para mostrar los espectros de emisión del destino y haga clic en Aceptar. A continuación, guarde el espectro adquirido antes de seleccionar una nueva región.
Aquí, se muestra una imagen de campo brillante de un cristal grabado después de ajustar la muestra en el enfoque adecuado. La morfología en forma de aguja del cristal se puede observar claramente. Aquí, se pueden observar imágenes del mismo cristal bajo excitación UV con iluminación completa o iluminación confinada local.
La iluminación confinada se puede utilizar para investigar los efectos de la energía o la transferencia de luz dentro del cristal que pueden desencadenar un comportamiento similar a una guía de onda. Por ejemplo, en esta imagen, se detecta una fuerte emisión en un punto que no está directamente bajo excitación, lo que sugiere que la migración eficiente de la energía tiene lugar a través del cristal. A partir del cubo hiperespectral adquirido, también es posible obtener la distribución espectral en forma de imagen, que representa una longitud de onda específica.
El perfil de intensidad de una longitud de onda de emisión específica y los espectros de emisión en cualquier píxel o área del cubo hiperespectral adquirido. Por ejemplo, los espectros de emisión para este análisis muestran las bandas de emisión más características del iones europium. Además, el perfil espacial a lo largo de las diferentes caras cristalinas indica una emisión más brillante en la punta y las caras laterales y se puede correlacionar con las distancias de iones de lantanoide/lantanoide en las tres direcciones espaciales.
Para obtener una buena señal en un tiempo de grabación razonable del cubo hiperespectral, es importante ajustar las configuraciones del microscopio, el enfoque y el tiempo de exposición del detector. Emisiones excitación UV y emisión visible, esta técnica se puede realizar utilizando la excitación infrarroja cercana y la detección de emisiones infrarrojas cercanas. Esto permite que sea aplicable para una gran variedad de materiales luminiscentes.
La correlación de señales ópticas con una serie de características dependientes hace que esta técnica sea muy interesante para la investigación de las relaciones estructura/propiedad, incluida la evaluación in vitro de las interacciones nanobio.
