Este protocolo permite el registro de una relación de respuesta de concentración funcional completa del agonista GPCR de una población celular y proporciona una caracterización agonista detallada incluso para números de muestra de células bajos. La principal ventaja de la dosificación en serie es el aumento del rendimiento, ya que un único pozo es suficiente para un análisis completo de la respuesta de concentración. Esta técnica es adecuada para estudiar una sola transducción en modelos biológicos raros y complejos, como formatos de órgano en chip en envases microfluídicos cerrados.
El protocolo no es difícil de realizar, siempre que el equipo adecuado esté disponible. Preparar las diversas soluciones de ligando GPCR en la concentración correcta es la clave del éxito. Michael Skiba, un estudiante de posgrado, y Anne Mildner, una estudiante de pregrado, de nuestro laboratorio demostrarán el procedimiento.
Para la siembra celular en las matrices de electrodos, agregue la concentración adecuada de células a los pozos de cada matriz de electrodos, y permita que las células se asienten homogéneamente en los fondos de los pozos durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente. Después de al menos 36 horas en una incubadora de cultivo celular estándar a 37 grados Celsius y 5%dióxido de carbono, inspeccione las capas celulares por microscopía de contraste de fase para asegurar una cobertura completa de cada electrodo con células. A continuación, reemplace el medio de cultivo celular en cada pozo con el volumen adecuado de medio precalecido y libre de suero.
Para iniciar una grabación de impedancia, coloque la matriz de electrodos en el soporte de la matriz de conexión del analizador de impedancia y confirme un contacto adecuado de baja impedancia entre los electrodos y el analizador de impedancia. Seleccione el tipo de electrodo y/o el formato multi-pozo en la interfaz de usuario del software. Si hay modos de adquisición de datos de frecuencia única y múltiple disponibles y el número de pozos que se analizarán es bajo o la resolución de tiempo no es crítica, seleccione varias grabaciones de frecuencia.
Para garantizar una resolución de tiempo máxima, seleccione una única frecuencia de supervisión. A continuación, inicie la adquisición de los datos del curso de tiempo y seleccione la carpeta de datos para dónde guardar los datos. Las lecturas de impedancia se registrarán en el número especificado de frecuencias para cada pozo Para iniciar el protocolo de adición en serie en el modo agonista para una matriz de ocho pozos, agregue 30 microlitros de la concentración más baja del agonista de interés para las células.
Luego deje que las células respondan y equilibren durante el período de tiempo predefinido antes de agregar 30 microlitros de la siguiente concentración más alta hasta que se haya añadido cada dilución en serie del agonista. Para analizar los datos, reste la impedancia del último punto de datos antes de la primera adición de la solución agonista y establezca el tiempo de adición cero para normalizar los valores de impedancia. Trazar el curso de tiempo de impedancia normalizada y trazar los cursos de tiempo individuales para identificar la máxima en impedancia después de cada paso de adición.
Componga una hoja de datos con estos valores y trace los valores del cambio de impedancia máxima en función de la concentración agonista. A continuación, utilice una rutina de ajuste de datos para determinar las concentraciones efectivas medio máximas y la respuesta máxima utilizando el modelo logístico de cuatro parámetros. En este experimento representativo, se añadieron secuencialmente a las células 10 soluciones con concentraciones crecientes de histamina cada 15 minutos, y el cambio en la impedancia se midió en cada punto de tiempo.
Los cambios de impedancia podrían trazarse en función de la concentración de histamina y la función de transferencia de un modelo logístico de cuatro parámetros instalado en los puntos de datos experimentales de siete pozos. Para tener en cuenta la posible reducción del receptor de histamina, la desensibilización celular o la sobreestimulación, el rango de datos para el análisis se puede reducir, como se muestra para este experimento de dosificación en serie único. La optimización de tres parámetros se puede aplicar a los datos, proporcionando una concentración efectiva medio máxima de 0,75 más o menos 0,12 micromolares para este análisis.
La adición del antagonista de la histamina difenhidramina antagonista 20 minutos antes de la primera histamina resulta en un aumento retardado de la impedancia dentro del esquema de dosificación en serie, correspondiente a la necesidad de un agonista más alto para obtener una respuesta celular. En la relación de respuesta a la dosis, el efecto del antagonista se expresa como un desplazamiento hacia la derecha de las curvas, correspondiente a un aumento de la concentración efectiva a medio máxima, siempre que el antagonista sea un ligando competitivo en relación con el agonista. La aplicación exitosa del esquema de dosificación en serie es técnicamente fácil, pero requiere una planificación reflexiva, ya que es difícil realizar todos los pasos con el tiempo correcto.
La dosificación en serie ha allanado el camino para realizar estudios de respuesta a la concentración con otros sistemas de lectura que están limitados con respecto al número de muestras monitoreadas en paralelo. Las ventajas particulares de la dosificación en serie permiten el estudio de la transducción de señal mediada por receptores con lecturas completamente nuevas que son sensibles a otros cambios fenotípicos, como la citomecánica. Por favor, use guantes y gafas al preparar las soluciones de stock del agonista del receptor, ya que pueden ser peligrosas cuando se inhalan o se tragan.
