La agrupación en clústeres de receptores es omnipresente y a menudo necesaria para la señalización de una activación en cascada. Sin embargo, hay pocos métodos disponibles para medir el grado de agrupación en clústeres. Utilizamos fluorescencia de reflexión interna total, microscopía TIRF, para seguir la difusión de moléculas FGFR1-mEGFP en la membrana plasmática de células vivas.
Luego aplicamos el brillo numérico, el análisis N&B, para describir la dinámica de la agrupación en clústeres de receptores estimulado. TIRF es ideal para imágenes temporales rápidas de eventos moleculares que ocurren cerca de la superficie celular, mientras que N&B determina el estado oligomérico promedio de las moléculas fluorescentes en función de dónde se difuercen el volumen de iluminación del microscopio. De hecho, esta es una herramienta para conectar la organización temporal espacial de los receptores en la superficie celular donde están señalando.
N&B solo necesita el acceso a un microscopio con un módulo de adquisición rápida. Puede analizar grandes áreas de células vivas con solo el conocimiento básico de los métodos de fluctuación de fluorescencia. Este método se puede aplicar a proteínas que forman dimers o racimos y se puede etiquetar estequiométricamente con el tinte fluorescente.
Si las proteínas están en compartimentos intracelulares, se utilizan otros tipos de microscopios para adquirir las imágenes. Es importante preparar una construcción que exprese la forma monomérica del fluoróforo para medir en condiciones experimentales el brillo monomérico puro como control. El primer día, las células heLa de semilla en 1,5 mililitros de medio completo a una concentración de 100.000 a 200 000 células por mililitro en platos de fondo de vidrio.
Las semillas de seis a ocho replican los platos, e incuban en una incubadora a 37 grados centígrados. En el segundo o tercer día, las células han alcanzado la subconfluencia. Añadir medio libre de suero con plásmido proteico a la mitad de los platos, y añadir plásmidos de referencia con el monómero y dimer a la segunda mitad de los platos para transfecar las células.
Después de un día, compruebe que las células trans infectadas están adherentes a la parte inferior de los platos y la membrana celular es fluorescente. Deseche los platos con células desbordados o con muy baja fluorescencia. Cuatro horas antes del experimento, active la incubadora de temperatura del microscopio a 37 grados centígrados.
Encienda el microscopio, las computadoras y las cámaras, y espere a que las cámaras alcancen la temperatura de trabajo adecuada de menos 75 grados centígrados. Coloque una pequeña gota de aceite en la lente objetivo. Poner un plato de muestra en la incubadora del microscopio, y cerrar las puertas de la incubadora para dejar que la temperatura del plato se equilibre durante 10 minutos.
Encienda la lámpara de epifluorescencia y el láser de 488 nanómetros. Seleccione el modo de contraste de epifluorescencia para explorar la muestra, buscando una celda para enfocar desde la lente ocular. Seleccione el filtro adecuado para recoger la emisión verde a través de la cámara del microscopio con el paso de banda Ex 490/20 500 y el paso de banda Em 525/50 o similar.
Cambie del informe del ocular al informe de la leva en modo de epifluorescencia. Refine el enfoque y cambie al modo TIRF. A continuación, active la alineación automática siguiendo las instrucciones del microscopio TIRF.
Elija una profundidad de iluminación adecuada y optimice la dirección del campo evanescente. Cambie a una segunda cámara. Defina una región de interés de al menos 256 por 256 píxeles.
Establezca la exposición en un milisegundo y la ganancia EM en 1.000. Ajuste la potencia del láser a 0,5 milivatios. Es necesario tener cierta información sobre el coeficiente de difusión de la proteína porque el tiempo de exposición debe ser menor que el tiempo medio empleado por las moléculas fluorescentes en el volumen lumminado.
Ejecute una primera secuencia de prueba en condiciones iniciales y estime aproximadamente el valor de señal a ruido. Las condiciones son aceptables en señal-ruido igual a dos a tres o superior como se mide en la primera serie de tiempo. A continuación, utilice el control deslizante del sistema de división de emisiones que conecta la cámara número dos al microscopio para enmascarar un lado de la imagen.
Seleccione la opción de guardado automático del archivo de cámara. Inicie la adquisición de la serie de imágenes para un mínimo de 700 fotogramas con una relación señal-ruido mínima de dos. Sin sacar el plato del microscopio, agregue el ligando.
Seleccione una célula con una membrana de fluorescencia brillante e inicie rápidamente la primera serie de la carrera cinética. Busque una segunda celda y adquiera el segundo punto de tiempo de la cinética. Capture una nueva celda para cada punto de tiempo de la carrera cinética.
Para cada nuevo plato, repita la alineación de la línea láser y la optimización de la iluminación TIRF. Ahora convierta y guarde los archivos de imagen adquiridos con el software de la cámara como archivos tif. Importe archivos tif en la rutina de software de análisis activando el usuario gráfico N&B interfasa MATLAB.
Serie de descartes para las que el perfil de intensidad media muestra más del 10% de fotoblanqueo y series en las que ha habido una evidente distorsión o traducción de la membrana celular durante la adquisición. Recortar marcos que evidentemente están fuera de foco. Conservar para el análisis sólo series con al menos 500 marcos de tiempo.
Primero determine los parámetros de la cámara. Active la cámara de calibración de rutina. Seleccione un área de al menos 20 por 50 píxeles en la región de ruido del detector.
En la gráfica de frecuencia de registro frente a nivel digital, mueva el cursor rojo lineal para delimitar el gaussiano en la parte lineal de la curva. Active la tecla B. Aplique un binning mínimo de 2.2 para reducir la dispersión de los datos y para generar el histograma B-I.
Utilice el cursor cuadrado iterativo para inspeccionar el histograma B-I. Seleccione un ROI cuadrado para el análisis y genere el mapa B del ROI seleccionado. A continuación, guarde el archivo ASCII de los valores B asociados a la selección.
Importe el ASCII en un software gráfico para calcular la distribución de frecuencia de los datos y obtener el valor B promedio más o menos S.E.Aplique la ecuación de épsilon para derivar el brillo promedio para cada celda en cada punto de tiempo de la ejecución cinética. Normalice los datos de acuerdo con la ecuación de normalización, donde B't es el valor B promedio medido en el tiempo t después de la adición del ligando y B'0 es el valor B promedio medido en el momento t es igual a cero, que es 10 a 20 segundos después del ligando additino. Trazar el brillo medio normalizado frente al tiempo de adquisición para construir la ejecución cinética.
En este estudio, los resultados representativos de dos células HeLa en el mismo plato que expresa mEGFP-FGR1 capturados en el momento cero y siete, después de la adición de 20 nanogramos por mililitro de FGF2, se muestran aquí. En comparación con las construcciones de referencia, GPI-mEGFP y GPI-mEGFP-mEGFP dimer, toda la secuencia de análisis muestra la intensidad media de la serie temporal. Trazado de todos los valores B.
Histograma B-I. B-mapa del ROI elegido. Y el histograma de distribución B asociado.
Después de la estimulación con 20 nanogramos por mililitro de FGF2, las corridas cinéticas representativas que muestran el brillo promedio como función del tiempo describe el lento proceso de dimerización que persiste durante varios minutos en la superficie celular. Cuando se estimula con 50 microgramos por mililitro de NCAM-Fc, el perfil cinético revela transiciones rápidas y cíclicas del receptor en mezclas oligoméricas, que también alcanza valores de brillo superiores a los del dimer. Se observa repetidamente un valor medio normalizado de tres.
Es importante minimizar las variantes adicionales debido a que no hay fluctuaciones moleculares y blanqueo. Y las células deben estar bien adheridas al plato de fondo de vidrio, no cubierto, y no apilados. Si estamos interesados en una proteína que se difunde más rápido dentro de los compartimentos intracelulares, podemos aplicar tiempos cero más rápidos y usar escaneo en microscopios focales o multifoto para la imagen dentro de la célula.
Con nuestro enfoque, minimizamos los efectos perjudiciales del fotoblanqueo cuando queremos explorar la dinámica de eventos como la dimerización. Estos eventos controlan una variedad de respuestas celulares y son muy difíciles de probar en células vivas con otras técnicas.
