El cultivo de fibroblastos en el recapitular esferoide el tejido tumoral mucho mejor que el sistema 2D comúnmente utilizado en plástico rígido. Permite estudiar la diferenciación de fibroblastos en un ambiente similar a un tumor. En este método, la rigidez del trabajo plástico de cultivo celular no influye artefactos en la diferenciación de fibroblastos.
En su lugar, la influencia de la interacción de la matriz celular en la diferenciación inducida por tumores de fibroblastos se puede analizar in vitro. Para comenzar este procedimiento, obtener el medio de cultivo celular, que se complementa con 1%calor inactivado FBS y 1%estreptomicina de penicilina. Además, obtener una solución de seis miligramos por mililitro de metilcelulosa.
Mezclar una parte de la metilcelulosa con tres partes del medio de cultivo celular para preparar la solución de formación de esferoides. Resuspender fibroblastos normales inmortalizados recién descongelados u otros tipos de células como se indica en el protocolo de texto en la solución de formación de esferoides. Si se incluyen citoquinas o inhibidores de la integrina en el estudio, añadir estos compuestos a la suspensión celular con el fin de incrustados en los esferoides durante su formación.
Cuando proceda, añadir compuestos inhibidores junto con 10 nanogramos por mililitro de TGF beta uno para desencadenar la diferenciación en fibroblastos normales inmortalizados. Distribuya 100 microlitros de la solución de formación de esferoides en cada pozo de una placa de 96 múltiples pozos de fondo redondo. Pipetear la solución en cada pozo arriba y abajo varias veces para mezclar.
Luego, incubar la placa en la incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 24 horas para permitir que se forme un esferoide en cada pozo. En primer lugar, corte el extremo de una punta de pipeta para agrandar el orificio. Una vez completada la incubación, utilice esta pipeta de corte para recoger los esferoides en un tubo de reacción de 1,5 mililitros por condición experimental o por proteína a analizar.
Centrifugar los esferoides a 1000 veces G durante unos 30 a 60 segundos. Retire cuidadosamente la metilcelulosa que contiene sobrenadante pipeteando asegurándose de no molestar a los esferoides peletados. Se debe tener especial cuidado al transferir los esferoides a los tubos de reacción.
Asegúrese de que no tiene fuerzas de deriva de tijeras cortando la punta. También es importante que recojas todos los esferoides. Durante el paso de lavado, asegúrate de no perder los esferoides por aspiración.
Para lavar los esferoides añadir 50 microlitros de un X PBS. Centrifugar a 1000 veces G durante 30 a 60 segundos. A continuación, retire cuidadosamente el PBS pipeteando.
Dependiendo de la proteína a teñir, fijar los esferoides ya sea con 50 microlitros de 4%paraformaldehído y PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente. Lave los esferoides con PBS como se describió anteriormente. Permeabilizar las células con 0.1%tritón X y PBS durante cuatro minutos a temperatura ambiente.
Luego, lave los esferoides en PBS tres veces como se describió anteriormente. Añadir PBS que contenga 5%FBS y 2%BSA a los esferoides e incubar a temperatura ambiente durante una hora para bloquear sitios de interacción con proteínas no específicos. Ahora, incubar los esferoides con 30 microlitros de anticuerpos primarios y PBS con 2.5%FBS y 1%BSA a cuatro grados centígrados durante la noche.
Al día siguiente, lave los esferoides en PBS tres veces como se describió anteriormente. Después de esto, incubar los esferoides con 30 microlitros de anticuerpos secundarios y PBS con 2.5%FBS y 1%BSA a temperatura ambiente durante 90 minutos. Lavar los esferoides en PBS tres veces como se describió anteriormente.
A continuación, incubar las células con 30 microlitros de solución de tinción Dappy durante cuatro minutos a temperatura ambiente. Lave los esferoides en PBS una vez como se describió anteriormente. Con una pipeta Pasteur de vidrio, coloque los esferoides en un portaobjetos de vidrio y una gota de PBS.
Utilice un microscopio de escaneo láser para tomar imágenes de los esferoides por microscopía de fluorescencia a un aumento de 10 veces. Tome diferentes secciones transversales ópticas del esferoide en diferentes llanuras ópticas de la pila Z. Una imagen representativa de la tinción inmunofluorescente de los esferoides homo de los fibroblastos pancreáticos normales en comparación con los esferoides homo de los fibroblastos asociados al cáncer inmortalizado muestra una señal creciente para la subunidad alfa tres en las células diferenciadas.
La señal de fluorescencia de las células en el esferoide se cuantifica con las imágenes de la pila Z del esferoide 3D y los niveles transcripcionales del gen de tres subunidades alfa de integrina están determinados por qPCR. Todos estos resultados demuestran que la integrina alfa tres está regulada en fibroblastos asociados al cáncer inmortalizado en comparación con la contraparte normal. Esto demuestra que la integrina alfa tres beta uno puede considerarse un marcador para la diferenciación de fibroblastos pancreáticos.
Este método es ideal para capitular el tejido propio generalmente encontrado en órganos y masas de cáncer donde la rigidez de la matriz celular adicional determina el destino celular. El cultivo de esferoides es un modelo versátil que se puede combinar con otros ensayos analíticos después de la disociación esferoide, como la cantidad de PCR en tiempo real y la citometría completa. El paraformaldehído utilizado para la fijación de los esferoides es un agente químico peligroso.
Los guantes y el desgaste ocular deben usarse para protegerse.
