El micro-patrón es una herramienta muy poderosa porque permite estudiar las respuestas celulares para definir señales bioquímicas y biofísicas que las células encuentran en los organismos vivos. A diferencia de otros métodos, el descrito es más flexible para la generación de patrones. Por ejemplo, permite la producción de gradientes y micro-patrones de múltiples proteínas con alta reproducibilidad.
Nuestro grupo utiliza LIMAP no sólo para estudiar la búsqueda de caminos neuronales, sino también cómo otras células responden a las señales que tienen influencia en la proliferación celular, diferenciación y migración. El microdobo se utiliza para responder preguntas fundamentales en la biología celular. El conocimiento adquirido se puede utilizar para modificar los dispositivos existentes en la medicina regenerativa, por ejemplo, la reparación del nervio después de la lesión del nervio periférico.
Comience diseñando plantillas para el patrón en el software de dibujo digital. Seleccione un tamaño de imagen de 1. 824 píxeles de longitud y 1, 140 píxeles de ancho. Diseñe la plantilla y guarde la plantilla como un archivo TIFF de 8 bits.
Antes del patrón, limpie y active la superficie con un limpiador de plasma utilizando una presión de proceso de 1.000 a 1, 300 militores y una potencia de 29,6 vatios durante uno a cinco minutos. Utilice un plato de fondo de vidrio con un tamaño de pozo interior de 20 milímetros y un espesor de vidrio de 0,16 a 0,19 milímetros. Seleccione un plato de seis bienes o de un solo pozo, dependiendo del número de condiciones que se estén probando.
Corte las plantillas PDMS en condiciones estériles para asegurarse de que encajan en el pozo interior de fondo de vidrio. Retire los rellenos de micropocillos internos con fórceps estériles y pegue bien las plantillas en el vidrio. Prepare una solución PLL-PEG de 0,1 miligramos por mililitro en PBS y agregue 20 microlitros a cada micropocillos.
Luego, incuba el plato a temperatura ambiente durante una hora. Después de la incubación, retire 15 microlitros del PLL-PEG de cada pocóptica, y lávelo cinco veces con 20 microlitros de PBS sin dejar que se seque. Prepare un micropozo para crear un patrón de referencia eliminando 18 microlitros de PBS de un solo pozo y añadiendo cinco microlitros de fotoiniciador, dejando PBS en los micropocillos restantes.
A continuación, utilice un resaltador fluorescente para marcar un pozo de vidrio interior vacío. Coloque el pozo por encima del objetivo y ajuste el enfoque objetivo hasta que el logotipo de PRIMO y el eslogan se ocupen de sus celdas"están enfocados. A continuación, registre la posición Z del plano focal.
Para crear un patrón de referencia, visualice el borde del micropozo con el fotoiniciador utilizando la luz transmitida a través de la cámara y elija el símbolo ROI en el menú de la derecha. Seleccione PRIMO para cargar la plantilla de patrón deseada, que se proyectará en el ROI como una unidad de diseño. Vaya a una región periférica del micropocillos, seleccione Bloquear y ajuste el enfoque a la posición Z de calibración.
A continuación, seleccione Reproducir para empezar a fotopatterning el patrón de referencia. Lave el micropozo del patrón de referencia tres veces con 20 microlitros de PBS para eliminar el fotoiniciador. A continuación, agregue 20 microlitros de matriz extracelular con etiqueta fluorescente, o ECM, solución proteica.
Incubar el plato a temperatura ambiente durante 10 a 20 minutos, asegurándose de proteger bien la referencia de la luz. Después de la incubación, retire 18 microlitros de solución proteica y lave el pozo tres veces con 20 microlitros de PBS. Utilice un microscopio de epifluorescencia para visualizar el patrón de referencia.
Ajuste el enfoque en los bordes del patrón a través de la trayectoria de la cámara y grabe la posición Z de acuerdo con el mejor enfoque. Esta posición será el enfoque láser óptimo utilizado para el patrón posterior. En condiciones estériles, retire 18 microlitros de PBS de todos los micropocillos.
Añadir cinco microlitros del fotoiniciador a cada pozo, y homogeneizar por pipeteo arriba y abajo. Si modela varias proteínas en el mismo micropozo, cargue todos los conjuntos de plantillas de patrones deseadas simultáneamente. A continuación, seleccione el número de filas, columnas y dosis.
Guarde la configuración de la plantilla como archivo en el software. Navegue hasta el área donde se produjo el patrón de referencia y ajuste el enfoque a la posición Z óptima. A continuación, seleccione Reproducir para iniciar el fotopaso.
Las unidades de diseño se convierten de rojo a azul a medida que se completa el fotopatrón. Retire el fotoiniciador de los micropocillos lavándolos tres veces con 20 microlitros de PBS. Después del último lavado, retire 18 microlitros de PBS de cada micropocillos y agregue 20 microlitros de solución de proteína ECM.
Incubar el plato a temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos, asegurándose de protegerlo de la luz. A continuación, retire 15 microlitros de la solución proteica ECM y lave los micropocillos tres veces utilizando 20 microlitros de PBS. Para evitar la unión cruzada, agregue 20 microlitros de PLL-PEG, o BSA, a los micropocillos, e incubar el plato a temperatura ambiente durante una hora, en la oscuridad.
A continuación, retire 15 microlitros del agente bloqueador y lave todos los micropocillos tres veces con 20 microlitros de PBS. Retire 18 microlitros de PBS y agregue 5 microlitros del fotoiniciador a cada micropocillos, asegurando que el fotoiniciador sea homogéneo en toda la superficie de los micropocillos. Navegue hasta el primer micropozo y cargue la configuración de la plantilla guardada previamente.
A continuación, seleccione las acciones que se van a modelar para la segunda ronda de fotopatrón, asegurándose de anular la selección de las acciones de la primera ronda. Después del fotopatrón, retire el PLPP lavándolo con PBS. Luego, incuba durante 20 minutos con la segunda solución proteica ECM, y lava los micropocillos tres veces con 20 microlitros de PBS.
Utilice un microscopio de epifluorescencia para visualizar e imaginar los patrones impresos. Cuando esté listo para planchar las células, agregue un mililitro de medio con células al vidrio interior bien, asegurándose de cubrir todos los micropocillos. Y coloque el plato de cultivo en una incubadora de dióxido de carbono de 37 grados centígrados y un 5%.
Con el fin de garantizar que los patrones generados son una representación precisa de la plantilla, se obtienen mediciones de intensidad de fluorescencia a lo largo de las rayas, y de una región de fondo correspondiente por encima de cada franja. Los micromasmas definidos reproducibles se logran de 20 a 2 micrómetros de ancho, pero se puede observar un efecto de borde cuando la impresión cuenta con 20 micrómetros o más ancho. Las concentraciones de proteínas definidas se obtienen incubando con diferentes concentraciones de proteínas, o variando la dosis láser que se utiliza para cortar la película antiadhesiva.
La intensidad del láser es proporcional al nivel de escala de grises de la plantilla, generando gradientes de iluminación UV. La medición del perfil de intensidad de fluorescencia a lo largo de la franja de degradado, es lineal en la plantilla de patrón y en el patrón de degradado generado. Este protocolo se puede utilizar para crear micro-patrones con múltiples proteínas en el mismo micropozo, tales como patrones cruzados con rayas horizontales de fibronectina, y rayas verticales de laminina.
Pero es necesario un paso de bloqueo para evitar la unión cruzada de proteínas. Los patrones cruzados generados se pueden utilizar posteriormente para ensayos celulares con líneas celulares neuronales, o células CAD, o neuronas primarias, DRGs de rata. Al realizar este protocolo, los aspectos más importantes a recordar son hacer una calibración adecuada del sistema, no dejar que los micropocillos sequen durante los múltiples pasos de lavado, y el uso de los parámetros adecuados para la incubación y el bloqueo de proteínas.
El análisis del comportamiento celular suele implicar microscopía, como fluorescencia, lapso de tiempo, AFM. La caracterización adicional puede comprender otros métodos bioquímicos, como el perfilado de expresión génica.
