Este protocolo exhibe una fisiopatología muy comparable de la fibrosis de Crohn en humanos y también analiza los efectos inhibitorios mediados por la rapamicina en la fibrosis intestinal. La principal ventaja de este protocolo es que describe el desarrollo de la fibrosis intestinal en muy poco tiempo que varía de cuatro a ocho semanas, lo que nos da la oportunidad de estudiar la reparación de tejidos y la regeneración tisular. Este protocolo será útil para los investigadores que tienen prisa por conseguir el mecanismo de la fibrosis, y ayudar a encontrar una mejor tecnología para predecir la intervención para la fibrosis intestinal asociada de Crohn.
Para comenzar este procedimiento, afeite ratones adultos alrededor de la zona del cuello con el fin de pre-sensibilizarlos a TNBS a través de la exposición dérmica. A continuación, remoje un hisopo de coton con TNBS y aplíquelo en la zona afeitada del cuello del ratón. Ocho días después de la sensibilización, inducir la colitis por administración intrarectal una vez a la semana, durante seis semanas.
Para ello, aplique cuatro miligramos de TNBS en 25% de etanol utilizando un enema de 100 microlitros a través de una jeringa de un mililitro unida a una aguja de gavage de acero. Dar a los ratones de control 100 microlitros de 25% de etanol solamente. Después de anestesiar a los ratones, inyecte por vía intraperitoneal ya sea rapamicina a dos miligramos por kilogramo por día, o un vehículo, o ambos, todos los días de la semana durante tres a seis semanas para el control y ratones tratados con TNBS.
Después de esto, utilice los intestinos de ratones post-tratados de TNBS de seis semanas para analizar los ensayos extracelulares. Primero, abra el colon longitudinalmente en HBSS helado y lave el colon en HBSS. Usando tijeras estériles, corte el colon en trozos pequeños que estén aproximadamente cinco centímetros en HBSS.
Transfiera las piezas pequeñas del tejido del colon a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de tampón antes de la digestión. Agitar el tubo a 100 RPM en una incubadora a 37 grados Celsius durante 20 minutos. A continuación, pase la suspensión a través de un colador celular de 40 micrómetros y deseche el epitelio colonico adjunto.
Recoger el tejido restante del colador y digerirlo aún más en el tampón de digestión que contiene colagenasa Tipo IV y DNASE1 en 1X HBSS con 5%FBS durante 20 minutos en una incubadora a 37 grados Celsius mientras se agita a 100 RPM. Después de esto, vórtice los tejidos digeridos durante aproximadamente 20 segundos y pasarlo a través de un colador celular de 40 micrómetros para obtener fracciones de lámina propria. Centrifugar las fracciones de lamina propria a 700 veces G y cuatro grados Celsius para reducir las células.
A continuación, haga 100 mililitros de soluciones de medios de gradiente de 30% y 70% de densidad. Resuspender las células obtenidas en 10 mililitros de la solución del 30% y superponer esto encima de cinco mililitros de la solución del 70% en un tubo de 15 mililitros. Centrifugar el gradiente en estado libre de rotura a 1.000 veces G y temperatura ambiente.
Recoger la fase de anillo blanco que contiene los linfocitos de lamina propria, que estará entre las capas de 30% y 70% gradiente. Lavar las células obtenidas resuspendándolas en HBSS helado y centrifugando a 500 veces G y 10 grados Celsius durante 10 minutos. Luego resuspend las células en el buffer FACS.
Antes de la tinción de anticuerpos, primero bloquee la superficie celular de las células de lamina propria incubando con un bloqueador CD16 por 32FC en hielo durante 15 minutos. A continuación, incubar las células con anticuerpos anti-CX3CR1 PE junto con microperlas anti-PE en hielo durante 30 minutos para capturar las células enlazadas, luego lavar las células con tampón FACS. Pase el anticuerpo y las células unidas a cuentas a través de una columna de clasificación de células activadas magnéticas en un campo magnético para eliminar las celdas no enlazadas.
Lave las células tres veces con el tampón FACS. Después de esto, retire la columna del campo magnético y empuje el émbolo en la columna para producir las celdas unidas al cordón. Primero, bloquee las células de lamina propria con el bloqueador CD16 por 32FC antiratón sobre hielo.
Tensar las células incubando con anticuerpos anti-CD64, CD11c, CD11b, CX3CR1, Ly6C y MHC Clase II Luego clasif sino un citómetro de flujo FACS como se describe en el protocolo de texto. Lyse las células ordenadas para la preparación total del ARN y detectar citoquinas y marcadores fibrosos. Analizar la expresión de ARNm de marcadores fibrosos y análisis de citoquinas inflamatorias a partir de suspensiones aisladas de una sola célula a partir de purificación magnética.
Para comenzar la tinción y el análisis de la superficie celular, resuspendir entre 500,000 y 1 millón de células aisladas de lámina propria en 15 mililitros de tampón FACS. Incubar las células con anticuerpos anti-CD16 por 32 a una dilución de 1 a 50 en hielo durante 10 minutos. Después de esto, lave las células con 500 microlitros de tampón FACS helado para eliminar los anticuerpos no unidos.
Suspensión de una sola célula colónica de manchas superficiales con anticuerpos con etiqueta fluorescente a una dilución de 1 a 100 sobre hielo durante 30 minutos. Lave las células etiquetadas dos veces para eliminar los anticuerpos no unidos utilizando 500 microlitros de tampón FACS helado para cada lavado. A continuación, analice las celdas mononucleares etiquetadas por citómetro de flujo como se describe en el protocolo de texto.
Para comenzar la tinción y el análisis de la citoquina intracelular, utilice un kit de solución de permeabilización de fijación para fijar y permeabilizar las células manchadas de superficie de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Puerta de las células de lamina propria como se describe en el protocolo de texto para detectar el nivel intracelular de citoquinas beta IL-1. A continuación, lave las células añadiendo el búfer FACS y centrifugando a 200 veces G y cuatro grados Celsius durante cinco minutos para eliminar el exceso de búfer fijador.
Repita este lavado una vez. Para determinar el nivel de actina muscular lisa alfa, primero permeabilizar las células con el kit de solución de permeabilización de fijación. Incubar las células con anticuerpos anti-alfa SMA Alexa Fluor 488 a una dilución de 1 a 1000 en hielo durante 30 minutos.
Luego lave las células agregando el búfer FACS y centrifugando a 200 veces G y cuatro grados Celsius durante cinco minutos para eliminar el exceso de búfer fijador. Repita este lavado una vez. Realice el análisis FACS y a compona las celdas como se describe en el protocolo de texto.
En este estudio se adopta el modelo de colitis ratón TNBS para estudiar y dilucidar los mecanismos subyacentes de la fibrosis intestinal. Después de seis semanas de tratamiento con TNBS, se puede observar que la longitud del colon se acortó progresivamente en el transcurso del tratamiento con TNBS de aproximadamente cinco centímetros en el grupo de control a aproximadamente tres centímetros en el grupo TNBS. Para garantizar que el modelo de la enfermedad de TNBS Crohn sea comparable al modelo de fibrosis humana de Crohn y no sea un artefacto relacionado con la metodología, los marcadores fibrosos se analizan a varios niveles en un estudio detallado del curso.
La acumulación de células positivas de actina de músculo liso alfa y la deposición de colágeno dentro de las capas submucosas se han notificado en la mayoría de las incidencias de fibrosis y se considera como un sello distintivo para los eventos fibrosos Para comparar la fibrosis TNBS con la fibrosis asociada de Crohn, la expresión de marcadores de fibrosis y citoquinas se analiza en biopsia de tejido fresco del íleon de pacientes con CD activo o bajo remisión. Sorprendentemente, inducción marcada se observa del engrosamiento de las capas positivas de músculo liso alfa y aumento de la deposición de colágeno en secciones activas de CD. El análisis de manchas occidentales se realiza para confirmar la inducción de la expresión de actina de músculo liso alfa en muestras de CD activas.
Además, el análisis qPCR detecta una inducción significativa de marcadores de fibrosis. A continuación, se evalúan los efectos de la rapamicina, un inhibidor farmacológico de la actividad M4 para determinar un mecanismo para limitar la fibrosis TNBS. Los ratones son tratados con TNBS y rapamicina y se analizan los niveles de actina muscular lisa alfa y colágeno en la histología del colon.
Es importante recordar inocular la misma cantidad de TNBS a cada ratón y procesar células aisladas de lamina propria tan pronto como sea posible para evitar la pérdida celular, así como para mantener la viabilidad celular. Nuestros detalles del protocolo sobre la fibrosis TNBS y la remisión de la fibrosis, así como el factor inhibitorio de la rapamicina en la formación de fibrosis. Otro investigador puede estar interesado en el uso de esta técnica para encontrar un mejor objetivo de medicamentos para la fibrosis y el cáncer de colon.
Recuerde que TNBS es un irritante para la piel y se deben usar batas de laboratorio durante la manipulación para evitar el contacto con la piel.
