Los métodos presentados aquí nos permiten estudiar los mecanismos moleculares de la migración de células inmunitarias a través de las barreras cerebrales en la encefalomielitis autoinmune experimental, un modelo animal para la esclerosis múltiple. Al investigar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica y la actividad de la matriz-metaloproteasa al mismo tiempo en correlación espacial con la infiltración de células inmunitarias en secciones de tejido cerebral, podemos asociar precisamente estos eventos neuroinflamatorios a los signos clínicos de EAE. El manejo profesional de ratones enfermos necesita un entrenamiento en profundidad, así como la puntuación correcta de los signos clínicos de EAE.
Por lo tanto, la demostración visual es beneficiosa. Comience este procedimiento con la anestesia de ratones C57-Black/6 que se han alojado en condiciones específicas libres de patógenos como se describe en el protocolo de texto. Fijar el ratón anestesiado en una mano, e inyectar 30 microlitros de péptido MOG y completar la emulsión adyuvante de Freund por vía subcutánea en cada uno de los flancos de las piernas traseras, muy cerca de los ganglios linfáticos inguinales.
Ahora, coloque el ratón sobre su vientre e inyecte 20 microlitros de la emulsión MOG-péptido en el tejido graso blando tanto a la izquierda como a la derecha en la raíz de la cola. Además, inyectar una pequeña gota de la emulsión en el cuello del ratón. Inyectar 100 microlitros de solución de toxina de tos ferina intraperitonealmente en el ratón.
Sostenga la cabeza del ratón debajo del centro del cuerpo para evitar la inyección en el intestino. Reemplazar la dieta de mantenimiento a la dieta de cría con el fin de proporcionar a los ratones con alimentos de mayor contenido de energía antes y durante la enfermedad clínica esperada. Repita la inyección de toxina toxsis 48 horas después del primer tratamiento.
Compruebe el estado de salud de los ratones EAE cada mañana echando un vistazo dentro de las jaulas. Puntua a los ratones EAE cada tarde. Saca todos los ratóns individuales incluidos en el experimento EAE de la jaula y comprueba si la cola tiene tonus.
Mueva la cola hacia arriba con un dedo. Un ratón sano mantendrá su cola hacia arriba. Si eae clínica ha comenzado, el tonus de la cola será más bajo, visible por una caída gradual de la cola.
Eventualmente, el ratón no será capaz de levantar su cola en absoluto. Coloque cada ratón individual incluido en el experimento EAE en el banco limpio para observar y documentar el comportamiento de caminar. Consulte el texto para conocer los criterios de puntuación para la evaluación de la gravedad de la enfermedad, que es la puntuación EAE.
Evalúe y documente el peso de cada ratón incluido en el experimento. Para preparar soluciones de dexran, disolver 10 miligramos de tres-kilodalton Dextran Texas Red en 500 microlitros de 0.9% solución de cloruro de sodio y cinco miligramos de 10-kilodalton Dextran Alexa Fluor 488 en 250 microlitros de 0.9% solución de cloruro de sodio. Para la solución de trabajo de dextrán, justo antes de la inyección, pipetear 55 microlitros de 10 kilodalton Dextran Alexa Fluor 488 solución en stock sobre una pieza de película de sellado.
A continuación, agregue 55 microlitros de la solución de stock de tres kilodalton Dextran Texas Red. Mezclar y recoger 100 microlitros en una jeringa fina desechable. A continuación, coloque un ratón anestesiado en la posición lateral sobre la mesa.
Inyecte por vía intravenosa 100 microlitros de trazadores fluorescentes en el ratón antes de que el ratón se despierte. Deje que el trazador circule durante 15 minutos antes de realizar la perfusión de ratones como se detalla en el protocolo de texto. Llene un recipiente plano de dewar con hielo seco triturado, y agregue 2-metilbutano hasta que el líquido alcance aproximadamente un centímetro por encima de la bolsa de hielo seco.
Cubra con una tapa suelta, como una cubierta de cubo de hielo. Después de cortar la cabeza del ratón perfundido con tijeras afiladas, retire la piel y las orejas usando un conjunto más pequeño de tijeras. Diseccione cuidadosamente la tapa del cráneo cortando desde el foramen magnum hacia el frente a la izquierda y el lado derecho, para permitir el plegarse de la tapa del cráneo sobre el cerebro.
Luego, saca cuidadosamente el cerebro intacto de la base del cráneo mientras corta los nervios ópticos usando una espátula plana de metal. Coloque el cerebro sobre papel de aluminio. Corta el cerebro en tres pedazos colocando dos cortes coronales.
Las tres piezas representan el cerebro frontal, el cerebro medio y el cerebelo con tallo cerebral. Llene un Cryomold hasta el primer trimestre con una matriz de corte de temperatura óptima. Luego, coloca las rebanadas cerebrales en el Cryomold, con el lado anterior de cada pieza del cerebro mirando hacia abajo.
Cubra el tejido completamente con matriz. Coloque el Cryomold con el tejido en una orientación horizontal en el baño de 2-metilbutano. Asegúrese de que el tejido se congela de abajo a arriba en un minuto evitando sumergir todo el bloque de tejido en el baño.
Transfiera el tejido congelado a menos 80 grados Celsius para su almacenamiento. Consulte el protocolo de texto para la preparación de las secciones de tejido congelado. Recuperar secciones de tejido cerebral no fijos de seis micras que se habían preparado a partir de ratones EAE.
En una campana de humo, descongele las secciones dentro de la caja de congelación de plástico que contiene gel de sílice en la tapa para evitar la retención de agua en el tejido. Separe dos secciones de tejido en una diapositiva dibujando líneas con una pluma repelente al agua. Soluciones de reacción centrífuga durante cinco minutos a 13, 300 g a temperatura ambiente, y precalentó a 37 grados centígrados utilizando un baño de agua.
Luego, rehidrate las secciones del tejido durante cinco minutos a 37 grados Celsius usando un tampón de reacción 1X. Después de cinco minutos, vierta el tampón de reacción 1X. Añadir solución de reacción en las secciones tisulares e incubar durante cuatro horas a 37 grados centígrados.
A continuación, lave los portaobjetos cinco veces en agua doble destilada. Ahora, fije las secciones durante cinco minutos con metanol helado a menos 20 grados Celsius antes de lavarlas una vez con PBS a temperatura ambiente. Añadir 1%BSA en PBS a la sección, e incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente.
A continuación, deseche el búfer de la sección volteando la diapositiva sobre un tejido. Añadir cóctel de anticuerpos primarios a la sección, e incubar durante una hora a temperatura ambiente. Después de lavar las secciones dos veces con PBS, agregue un cóctel de anticuerpos secundarios e incubar durante una hora a temperatura ambiente.
A continuación, lave las secciones dos veces con PBS y monte las diapositivas con la solución de incrustación. Después de dejar que las secciones montadas se sequen durante la noche a temperatura ambiente, analice las secciones de tejido teñido con un microscopio fluorescente. La gravedad de la enfermedad EAE aumenta hasta el pico de la enfermedad, que puede esperarse entre los días 16 y 20 después de la inducción de EAE.
En el pico de EAE clínico, los ratones también mostraron el menor peso corporal, lo que aumenta en correlación con la mejora de EAE en la fase de remisión de la enfermedad. Aquí se muestra una imagen representativa del plexo coroides y el parénquima cerebral adyacente de un ratón C57-Negro/6 que sufre de EAE. El ratón se inyectó por vía intravenosa 15 minutos antes de sacrificarse.
Los trazadores se difunden fácilmente a través de los microvajillones fenestrated en el estoma del plexo coroides, mientras que la barrera hematoencefálica no permite la difusión de trazadores circulantes en el parénquima cerebral, que por lo tanto está desprovisto de cualquier señal fluorescente. Estas imágenes muestran vasos sanguíneos con fugas representativos en el cerebelo de un ratón C57-Black/6 que sufre de EAE. Las puntas de flecha indican que los trazadores se difunden a través de los microjillones cerebrales hacia el parénquima del SNC, lo que sugiere que la función de barrera hematoencefálica está deteriorada en estos vasos.
En el parénquima del SNC, la señal fluorescente verde y roja es visible fuera de las paredes de los vasos sanguíneos. La correcta colocación subcutánea de la emulsión MOG-CFA es esencial para montar la respuesta inmunitaria adecuada que conduce a EAE. Debe evitarse la inyección intraperitoneal e intramuscular.
Prepare CFA bajo una campana de humo para evitar la inhalación de la Mycobacterium atenuada. Además, evitar la autoinyección con la emulsión MOG-CFA, ya que esto puede causar condyloma o incluso conducir a EAE en individuos que están genéticamente predispuestos. Las células inmunitarias infiltrantes cerebrales se pueden aislar del SNC de ratones que sufren de EAE para cuantificar subconjuntos de células inmunitarias infiltrantes durante la neuroinflamación por citometría de flujo.
La evaluación de la integridad de las barreras cerebrales endoteliales y gliales se puede traducir al análisis de modelos de ratón modificados genéticamente o a modelos de otros trastornos neurológicos.
