Este método permite la cuantificación precisa de las histonas de núcleo H3 y H4 y sus modificaciones post-traduccionales de extractos celulares y tisulares, lo que conduce a la generación de resultados reproducibles de alta calidad. La técnica presentada tiene tres ventajas principales. En primer lugar, conserva las modificaciones nativas post-traduccionales de las histonas.
En segundo lugar, omite los costosos métodos de bajo rendimiento. Por último, es totalmente compatible con las aplicaciones de rendimiento medio posterior. Demostrando el procedimiento será Karolina Janczura una talentosa estudiante de posgrado de mi laboratorio que optimizó completamente este protocolo y empleó la técnica para responder a preguntas importantes sobre la regulación epigenética en la enfermedad de Alzheimer.
Para comenzar a platear las células en platos tratados con cultivo de tejido de 10 centímetros con los medios de cultivo celular apropiados de acuerdo con el protocolo de texto. Permita que las células crezcan hasta que alcancen alrededor del 90% de confluencia. Después de que las células hayan alcanzado la confluencia deseada aspirar suavemente los medios de cultivo y lavar las células dos veces con medios precalificados libres de suero.
Después de esto, retire los medios libres de suero de las células y coloque los platos de 10 centímetros sobre hielo. Agregue un mililitro de tampón de extracción en frío a cada plato. Usando un rascador de células de plástico recoger las células en el tampón de extracción y transferirlas a un tubo etiquetado de 1,5 mililitros.
A continuación, coloque los tubos sobre hielo. Si se utiliza tejido congelado, coloque el tejido en un tubo pre-enfriado de 1,5 mililitros y descongelarlo brevemente sobre hielo. A continuación, homogeneizar el tejido cerebral con un homogeneizador de mano utilizando la cantidad recomendada de tampón de extracción y el número de accidentes cerebrovasculares.
La homogeneización es completa cuando no hay fragmentos de tejido visibles y la solución adquiere un aspecto lechoso. Después de esto, utilice una pipeta de 1.000 microlitro de un solo canal para transferir el homogeneato a un tubo pre-enfriado de 1,5 mililitros y coloque los tubos sobre hielo. Coloque el tubo que contiene los licatos celulares y el tejido cerebral homogeneizado en una plataforma giratoria girando a 15 RPM a cuatro grados centígrados.
Después de esto, centrifugar el tubo a la velocidad máxima durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo pre-enfriado de 1,5 mililitros y deseche el pellet. A continuación, neutralice las histonas con un volumen de 1/4 de búfer de neutralización, y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
Utilice tiras de pH para comprobar el pH de la mezcla y ajuste aún más el pH con el tampón de neutralización si es necesario. Si las histonas ácidas no se neutralizan durante este paso, no se unirán a la membrana de la columna correctamente, pasarán a través de ella y se detectarán en el flujo a través. Agregue 37,5 microlitros de la muestra a 12,5 microlitros de tampón de muestra.
Después de una breve desnaturalturación de la centrifugación la mezcla a 99 grados centígrados durante 10 minutos. Después de esto, coloque los tubos sobre hielo y gírtelos brevemente para recoger el condensado. Cargue la muestra en un gel SDS-PAGE y ejecute el gel a 100 voltios durante una hora.
Luego tiñe el gel durante la noche. Y detenerlo durante tres lavados consecutivos. Primero agregue 500 microlitros de búfer de equilibrio a cada columna de giro.
Centrifugar la columna durante tres minutos. Deseche el flujo y repita la centrifugación una vez más. Después de esto agregue 500 microlitros de la muestra a la columna.
Centrifugar la columna durante tres minutos y recoger el flujo a través. A continuación, analice el flujo de columna como se describió anteriormente. Agregue 500 microlitros de tampón de lavado a la columna.
Centrifugar la columna durante tres minutos y recoger el flujo a través. Transfiera la columna a un nuevo tubo etiquetado de 1,5 mililitros. Agregue 50 microlitros de búfer de elución de histona a la columna.
Después de centrifugar la columna, guarde el flujo a través que contiene proteínas histonas. Bajo una capucha química añadir ácido perclórico a las histonas purificadas para lograr una concentración final de 4%ácido perclórico. Pipetear arriba y abajo seis veces para mezclar.
Si las histonas de la muestra están muy concentradas, la solución se nublará después de la adición de ácido perclórico. Después de esto, incubar el tubo a cuatro grados centígrados durante 24 horas. Si la precipitación de histona durante la noche es exitosa, un pequeño pellet blanco será visible en la parte inferior del vial después del paso de centrifugación.
Al lavar el pellet en los pasos consecutivos asegúrese de que el pellet no se perturba, ya que puede separarse fácilmente del fondo del vial. Al día siguiente centrifugar las muestras durante 75 minutos en tubos de microcentrífuga preenfriados. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y añadir 500 microlitros de ácido perclórico helado a la muestra peletizadora.
Después de centrifugar la muestra durante 10 minutos a la velocidad máxima, aspire el sobrenadante. Agregue 500 microlitros de acetona helada a la muestra teniendo cuidado de no molestar el pellet. A continuación, retire el sobrenadante y deje que los tubos se sequen sin acocar sobre hielo durante 30 minutos.
A continuación, retire los tubos del hielo y deje que la muestra se seque a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de que el pellet se resuspenda en 30 microlitros de agua estéril. Tapa los tubos y deja que las histonas se reconstituyen sobre hielo durante 30 a 50 minutos.
Después de comprobar que el pellet se resuspended, recapitula los tubos y retírelos del hielo. En este protocolo se purificaron las histonas de células BV-2 microgliales humanas y se analizó la composición del extracto. El gel teñido demuestra que los tiempos de extracción entre 15 minutos y 24 horas no afectaron a la composición general de los extractos de histona cruda.
La eficiencia de la unión de histona a la matriz de la columna se analizó mediante la tinción del gel. La eficiencia de la columna fue aproximadamente del 100%, como lo demuestra la ausencia de proteínas histonas detectables en el flujo de la columna. Independientemente de la duración del tiempo de extracción, es decir.
15 minutos, dos horas o 24 horas. lavado de primera columna elimina la mayor cantidad de proteínas no histonas del extracto. Las fracciones de proteína histona purificadas del grupo de extracción de 24 horas contenían más histonas H3 y H4 en comparación con los tiempos de extracción de 15 minutos y dos horas.
La primera elución de columna fue aproximadamente 100%eficiente como lo demuestra la falta de proteínas histonas en el segundo eluido. Luego se extrajeron histonas crudas de todo el cerebro del ratón y se midieron modificaciones post-traduccionales. En respuesta al inhibidor de HADC de acción amplia, tributilrina, acetilación H4K12 aumentó en el extracto.
Sin embargo, la especificidad del anticuerpo disminuyó debido a la presencia de impurezas en el extracto crudo. El protocolo de purificación de histona se completó con la corteza prefrontal de ratones triples transgénicos A/D tratados con el inhibidor de la HDAC de Clase I e IIb, M344, y se evaluó la fracción de histona de núcleo puro única para cambios en la acetilización H4K12. Se detectaron histonas totales y se observó un aumento significativo de la acetilación H4K12 en respuesta a M344.
Al intentar este procedimiento es importante recordar realizar los múltiples puntos de control descritos dentro del protocolo para validar la purificación exitosa de la histona durante todo el proceso. Siguiendo este procedimiento, se pueden abordar preguntas adicionales sobre la fosforilación de histona y el estado de metilación. El desarrollo de esta técnica allanó el camino para que los investigadores de nuestro laboratorio analizaran los mecanismos genéticos involucrados en la enfermedad de Alzheimer.
Sin embargo, se puede utilizar en una variedad de modelos de enfermedad donde la modificación de la cromatina se presume para desempeñar un papel significativo.
