Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre los mecanismos y la energía del transporte de proteínas a través de las membranas de cloroplasto, así como la ubicación de proteínas dentro de los plastoides. La principal ventaja de esta técnica para la focalización de proteínas tilakoide es que permite un control completo del entorno del tilakoid durante el transporte, incluyendo temperatura, pH, condiciones iónicas y concentraciones precursoras. Comience remojando aproximadamente 55 gramos de guisantes en 400 mililitros de agua destilada durante tres horas.
Sembrar los guisantes empapados en una bandeja de plástico en el suelo, cubiertos con una fina capa de vermiculita, y crecer durante nueve a 15 días como se describe en el protocolo de texto. El día del aislamiento de cloroplasto, prepare un gradiente de densidad continua centrifugando una mezcla de 15 mililitros de Percoll y 15 mililitros de tampón de 2xGB en un tubo centrífuga de policarbonato de 15 mililitros a 30.900 gs en un rotor de ángulo fijo durante 30 minutos a cuatro grados Celsius con el freno apagado. Luego cosecha aproximadamente 25 gramos de brotes de guisantes de nueve a 15 días de edad.
Añádalos a 95 mililitros de tampón frío de 1xGB en una licuadora refrigerada, con cuchillas afiladas. Y homogeneizar. Filtrar esta mezcla a través de un mínimo de dos capas de tela de queso, colocadas en un embudo sobre un vaso de precipitados refrigerado.
Centrifugar el filtrado utilizando un tubo centrífuga de policarbonato de 15 mililitros en un rotor de cucharón oscilante a 3.000 gs durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y use un pincel para resuspender suavemente el pellet en un mililitro de 1xGB. Después de eso, utilice una pipeta de postura de vidrio para colocar cuidadosamente la suspensión de la pantalla en la parte superior del degradado Percoll.
Centrifugarlo en un rotor basculante a 8.000 gs durante 10 minutos a cuatro grados centígrados con el freno apagado. Con una pipeta de postura, transfiera de nuevo cuidadosamente la banda verde inferior que contiene cloroplastos intactos a un tubo de policarbonato fresco de 50 mililitros y agregue 30 mililitros de tampón 1xIB. Centrifugar el tubo en un rotor basculante a 1.800 gs durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.
Después de desechar el sobrenadante, resuspender suavemente el pellet en un mililitro de 1xIB con un pincel. Lavar en 30 mililitros de 1xIB y centrifugar de nuevo en las mismas condiciones. Resuspender el pellet después de la centrifugación final en un mililitro de 1xIB.
Para determinar la concentración de clorofila, mezcle 10 microlitros de cloroplastos completamente resuspendidos con cinco mililitros de 80%acetona. Filtrar a través de un papel de filtro de 180 micrómetros de espesor con un tamaño de poro de 11 micrómetros y luego determinar la concentración de clorofila por espectrofotómetro. Diluir la mezcla de cloroplasto a un miligramo por mililitro usando 1xIB frío.
Para empezar a aislar los tilakoids cuando no es necesario un extracto estromal, como el transporte cpTat, los cloroplastos intacto centrifugados en tubos de 1,5 mililitros en un rotor basculante a 1.000 gs a cuatro grados Centígrados durante seis minutos. Después de eso, deseche el sobrenadante y resusppend el pellet en tampón de lysis hipotónica para lograr un miligramo por mililitro con una micropipeta. Incubar sobre hielo en la oscuridad con mezcla ocasional durante 10 minutos.
Para recuperar tilokoides, centrifugar en un rotor de cubo oscilante a 3.200 gs a cuatro grados centígrados durante ocho minutos. Lavar los tilokoides dos veces resuspendiendo el pellet con uno o dos mililitros de tampón de lelisis y luego centrifugar en las mismas condiciones. Después de la centrifugación final, resuspender el pellet, en un mililitro de tampón 1xIB y determinar la concentración de clorofila en tilokoides aislados utilizando un espectrofotómetro como se demostró anteriormente.
Para vías que requieren recuperación de extractos estromales como CPSec1 y CPSRP eliquate 600 microlitros de cloroplastos aislados en un rotor de cubo oscilante y centrífuga a 1.000 gs durante seis minutos a cuatro grados Celsius. Para la lelisis de cloroplasto, suspendemos el pellet con 600 microlitros de tampón de lysis hipotónica. Incubar sobre hielo en la oscuridad durante 10 minutos con mezcla ocasional.
A continuación, centrifugar los tubos en un rotor de cubo oscilante a 3,200 gs durante ocho minutos a cuatro grados Centígrados. Para salvar el estroma, transfiera el sobrenadante de verde claro a amarillo a un nuevo tubo de micro centrífuga y agregue un volumen igual de tampón estromal crudo 2x. Para lavar los tilokoides, agregue dos volúmenes de tampón de lesis y centrífuga a 3.200 gs durante ocho minutos a cuatro grados centígrados.
Resuspender el pellet en 1xIB para lograr la concentración de clorofila de un miligramo por mililitro y reservar sobre hielo para su uso posterior en ensayos de transporte. Retire las membranas residuales del estroma crudo centrifugando el estroma crudo diluido en un rotor de ángulo fijo a 42.000 gs durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, recoger el 95% del volumen de cada tubo asegurándose de no molestar el pequeño pellet verde amarillo, mientras que la nota del volumen tomado de cada tubo.
Para preparar el extracto estromal concentrado, a la piscina de los sobrenadantes recogidos. A continuación, utilice un concentrador de corte de peso molecular de cuatro mililitros de 30 kilodalton para concentrar el extracto cinco veces. Para ensayar el transporte cpTat en un tubo de 1,5 mililitros en hielo mezclar los tilokoides aislados a una concentración final de clorofila de 0,33 miligramos por mililitro, cinco ATP miliamperión preparados en 1xIB, y ocho TDT milimolares preparados en 1xIB.
Para iniciar el transporte, introduzca la proteína de sustrato en la mezcla de transporte. Lleve a cabo la reacción iluminando la suspensión con 80 a 100 microeinistes por metro cuadrado por segundo de radiación fotosintéticamente activa durante 10 minutos a temperatura ambiente. Para detener la reacción de transporte, diluya la suspensión ocho veces con hielo frío 1xIB.
Centrifugar a 3.200 gs en una micro centrífuga durante cinco minutos a cuatro grados Celsius para recuperar los tilokoides. Después de desechar el sobrenadante, resuspender el pellet en 120 microlitros de hielo frío 1xIB. Para ensayar las vías CPSec1 o PSRP, mezcle lo siguiente en un tubo de 1,5 mililitros sobre hielo.
Tilakoids a una concentración final de clorofila de 0,33 miligramos por mililitro, 0,83 miligramos por mililitro de equivalentes de clorofila de extracto estromal, y cinco ATP milimiolares preparados en 1xIB. Lleve la reacción al volumen deseado con hielo 1xIB e incubar sobre hielo durante 10 minutos. Para iniciar el transporte introducir 10% volumen por volumen de proteína de sustrato a esta mezcla de transporte.
Ilumina con 80 a 100 microeinistentes por metro cuadrado por segundo de radiación fotosintéticamente activa durante 10 minutos a temperatura ambiente. Para detener la reacción, diluya la suspensión ocho veces con hielo frío 1xIB. Centrifugar a 3.200 g en una micro centrífuga durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.
Después de desechar el sobrenadante, resuspender el pellet en 120 microlitros de hielo frío 1xIB. Para eliminar el sustrato residual que no se ha transportado, digiere la proteína externa añadiendo seis microlitros de dos miligramos por mililitro de termoxlisina y 10 cloruro de calcio militrolar en 1xIB. Incubar esta reacción proteasa sobre hielo durante 40 minutos.
Aprieta la proteasa duplicando el volumen con 25 EDTA milimétricas en 1xIB. Centrifugar a 3.200 gs en una micro centrífuga durante cinco minutos a cuatro grados Celsius para recuperar los tilokoides. Después de quitar el sobrenadante, resuspend resuspenda recuperó tilokoides en 120 microlitros de cinco EDTA milimolar en 1xIB, y se transfirió a un nuevo tubo de 1,5 mililitros.
Después de centrifugar de nuevo a 3.200 gs en una micro centrífuga durante cinco minutos a cuatro grados centígrados, deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet en un volumen adecuado de tampón de muestra de laemmli, complementado con EDTA de 10 milimolares. Coloque las muestras en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos. Proceda a analizar las muestras por página SDS.
El transporte de la proteína iOE17 a través de la vía cpTat dio lugar a un cambio de tamaño de dos a tres kilodaltones entre el sustrato introducido y la forma procesada madura. Esto se debe a la escisión del péptido de señal terminal n que indica un transporte cpTat exitoso. El tratamiento con termolización deja sólo la banda madura transportada con éxito y por lo tanto resistente al proteo.
El transporte del precursor OE33 a través de la vía CPSec1, resultó en un cambio de tamaño en el sustrato maduro, y la protección proteus del sustrato transportado. La inserción del precursor de LHCP en la membrana tilokoidea a través de la vía cpSRP, evaluada a través de la digestión de la termoestina condujo a un cambio de tamaño de 1,5 a dos kilodaltons. Esto indicó la inserción exitosa de la membrana, ya que la membrana protege el producto de degradación LHCP maduro de la proteólisis completa.
Después de ver este video usted debe tener una buena comprensión de cómo aislar los tilokoides y el ensayo de tranportividad a través de las vías cpTat, cpSec 1 y cpSRP dependientes de la energía. Una vez dominada esta técnica se puede hacer en tres a cuatro horas cuando se realiza correctamente. Aunque no se ilustra en este video, generalmente mantenemos las luces aéreas apagadas en el laboratorio al aislar y trabajar con cloroplastos y tilakoidos fotosintéticamente activos.
Al intentar este procedimiento es importante mantener aislados cloroplastos y tilaxoides a cuatro grados centígrados. Recuerde resuspend cloroplastos suavemente al principio. Evite alterar el gradiente Procoll después del primer paso de centrifucación.
Además, el porcentaje de muestra de entrada se puede preparar en paralelo con las reacciones de transporte y funcionar con el mismo gel para estimar el transporte del sustrato. No olvide que trabajar con sustratos radiactivos requiere un manejo concienzudo y un EPP adecuado. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la focalización proteica exploraran la energía, la cinética y los mecanismos únicos que rigen el transporte de proteínas a través de las membranas tilakoideas.
