Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la energía, como la salud mitocondrial, la eficiencia energética y el uso de energía. La principal ventaja de esta técnica es que el consumo de oxígeno de las mitocondrias aisladas se mide directamente. No es necesario corregir los resultados para otros procesos metabólicos intracelulares.
Primero decidimos seguir este método en el ganado lechero cuando queríamos examinar cómo la eficiencia mitocondrial afecta la eficiencia de los piensos. La demostración en vídeo de este método es fundamental, ya que los pasos en el aislamiento mitocondrial son difíciles de aprender porque necesitan ser consistentes y precisos. Tan pronto como sea posible después de que se extraiga la muestra de hígado de la vaca lave la muestra en medios de aislamiento de las mitocondrias para eliminar los glóbulos rojos.
Usando tijeras picar finamente el tejido en un vaso de precipitados refrigerado que contiene suficientes medios de aislamiento para mantener el tejido húmedo. Transfiera el hígado picado a un vial de vidrio de 30 mililitros que contenga medios de aislamiento de mitocondrias. Añadir un pestle de teflón que tenga un aclaramiento de 0,16 milímetros y que haya sido incubado en hielo y homogeneice la muestra de hígado a 500 RPM durante un minuto con cuatro golpes por minuto.
Después de esto, transfiera el homogeneato a un tubo que contenga medios de aislamiento de las mitocondrias y colóquelo en un vaso de precipitados lleno de hielo. Centrifugar homogeneizar a 500 veces G y cuatro grados celsius durante 10 minutos. Deseche el pellet y transfiera el sobrenadante a un tubo de centrífuga refrigerada.
Centrifugar el sobrenadante resultante a 10.000 veces G y cuatro grados Celsius durante 10 minutos para obtener el pellet mitocondrial. Resuspender y lavar el pellet en 10 mililitros de medios de aislamiento de mitocondrias con BSA libre de ácidos grasos. Luego centrifugar a 8, 100 veces G y cuatro grados Celsius durante 10 minutos.
Deseche el sobrenadante y resuspender el pellet en 200 microlitros de medios de aislamiento. Coloque esto sobre hielo hasta que esté listo para usar para el consumo de oxígeno y los ensayos cinéticos con fugas de protones. Determinar la concentración proteica de la suspensión de pellets utilizando un kit de ácido bicinchoninic según las instrucciones del fabricante utilizando BSA como estándar.
En primer lugar, cree medios de consumo de oxígeno como se describe en el protocolo de texto. Incubar los medios de consumo de oxígeno a 30 grados centígrados. A continuación, configure la cámara de respiración, la bomba y el electrodo de oxígeno para el sistema de oxigrafía de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
A continuación, coloque un mililitro de medios de consumo de oxígeno en la cámara de respiración. Luego agregue 0,35 miligramos de proteína mitocondrial a la cámara. Revuelva vigorosamente para asegurarse de que la solución se satura con aire y mantenga una temperatura de 30 grados centígrados.
Registre el consumo de oxígeno durante aproximadamente cinco minutos. Cuando el consumo de oxígeno se convierte en constante representado por una línea recta decreciente, registre esto como el consumo de oxígeno basal. Añadir 1,25 microlitros de una solución de rotenona de cuatro mililitrolares para inhibir la solución compleja, y luego añadir cinco microlitros de una solución de succinato molar para alcanzar una concentración final de cinco succinatos mililolares en la cámara respiratoria.
Este es el consumo de oxígeno del estado IV. Después de esto, añadir un microlitro de una solución ADP de 100 mililitros para alcanzar una concentración final de 100 micromolares en la cámara de respiración. El consumo de oxígeno disminuirá durante aproximadamente cinco minutos y luego se convertirá en una línea recta.
Registre este consumo de oxígeno como la respiración del estado III. Calcular la relación de control respiratorio como se describe en el protocolo de texto. A continuación, aspirar todas las soluciones fuera de la cámara de respiración.
Enjuague la cámara varias veces con agua desionizada doble. En primer lugar, preparar una solución de 80 nanogramos por mililitro de nigericin en etanol limitando la cantidad de etanol añadido a menos de un microlitro. Además, preparar una solución de ocho microgramos por mililitro de oligomicina en etanol.
Después de enjuagar a fondo la cámara con agua desionizada doble, coloque un mililitro de los medios de consumo de oxígeno en la cámara de respiración y revuelva vigorosamente con una barra de agitación magnética. Añadir 0,35 miligramos de proteína mitocondrial a la cámara de respiración. Agregue un electrodo sensible al triphenylphosphonium metilo a la configuración de la cámara asegurándose de que el otro extremo esté conectado correctamente a un medidor de pH.
Añadir 1,25 microlitros de una solución de rotenona de cuatro mililitrolares para inhibir el Complejo I.Grabar la respiración durante dos a cinco minutos. Registre el valor de consumo de oxígeno cuando se vuelva constante. A continuación, agregue 0,56 microlitros de una solución de oligomicina para inhibir la utilización de ADP.
Registre la respiración durante unos dos a cinco minutos. Registre el valor de consumo de oxígeno cuando se vuelva constante. A continuación, agregue 0,112 microlitros de una solución de 80 nanogramos por mililitro de nigericiina para abolir el gradiente de pH a través de la membrana interna mitocondrial.
Registre la respiración durante dos a cinco minutos y observe el valor de consumo de oxígeno cuando se vuelve constante. Añadir cinco microlitros de 10 mililitros de solución de metil triphenylphosphonium a la incubación mitocondrial para comenzar a preparar una curva estándar. Repita esta adición cuatro veces adicionales hasta una concentración total de 2,5.
micromolar ha sido añadido. Después de esto, agregue cinco microlitros de una solución de succinato molar a la cámara para iniciar la respiración. Registre la respiración hasta que se logre un rastro estable.
A continuación, agregue malonato para valorar el sistema como se describe en el protocolo de texto. En este estudio, la cinética de fugas de protón y RCR se mide en la leche de vacas lecheras Holstein 70 días después de que las vacas lecheras se hubieran alimentado con diferentes niveles de cobre, zinc y manganeso durante 28 días. La respiración del Estado IV se considera la más alta en las vacas dados bajos niveles de manganeso, sin embargo, es más baja en las vacas de control, lo que indica que el manganeso juega un papel importante en la minimización de la respiración dependiente de la fuga de protones.
El análisis de la respiración dependiente de la fuga de protones hepáticos revela que esta respiración es mayor en vacas tratadas con manganeso bajo, y la más baja en vacas de control. Estos resultados confirman que el grupo de manganeso bajo tiene la mayor respiración de estado IV mientras que el grupo de control tiene la más baja. Si bien la eficiencia de alimentación es mayor en los novillos Angus nacidos de toros RFI bajos que los toros RFI altos, esto no se refleció en el RCR mitocondrial o en la cinética de fugas de protones.
Durante la realización de este procedimiento es importante mantener todos los viales y vasos en el hielo mientras se procesa la mitocondria. Después de su desarrollo esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la nutrición láctea exploraran el papel de la eficiencia de las mitocondrias en la eficiencia de los piensos y la función mitocondrial en el hígado. No olvide que trabajar con rotenona puede ser peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como usar guantes, protección para los ojos y EPP adecuada durante la realización de este procedimiento.
