Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del sistema, como el mecanismo de regulación detrás de la red mitótica y las propiedades y funciones dinámicas del reloj del ciclo celular. La principal ventaja de esta técnica es que generará una gran cantidad de gotas con múltiples ciclos celulares en cada una, proporcionándonos un marco de alto rendimiento para la manipulación y análisis cuantitativo. Para empezar, deseche lotes de huevos que tengan límites poco claros entre los polos animales y vegetales o manchas blancas irregulares en la parte superior de los postes de animales.
A continuación, seleccione un lote apropiado de huevos de una rana hembra y transfiera los huevos a un vaso de precipitados de 600 mililitros. Vierta un exceso de tampón MMR 0.2x, y agregue suavemente cisteína en tampón de extracto 1x a los huevos. Después de esto, agitar el vaso vigorosamente a mano para eliminar las capas de gelatina de los huevos.
Repita este lavado tres veces con un total de 800 mililitros de tampones de cisteína o hasta que los huevos se agreguen y se asienten en la parte inferior del vaso de precipitados. Después de retirar la capa de jalea, lave los huevos cuatro veces en un litro de solución 0.2x MMR. Use una pipeta de vidrio para recoger y desechar los huevos que se vuelven blancos.
Vierta el tampón MMR fuera del vaso de precipitados y agregue 200 mililitros de solución de ionóforo de calcio en los huevos. Use una pipeta de vidrio para agitar los huevos suavemente hasta que se activen y retire la solución de ionóforo de calcio. Dejar los huevos en solución de ionóforo de calcio durante demasiado tiempo iniciará la apoptosis.
Remuevemos los huevos durante 1,5 minutos y comprobamos la eficiencia de activación. Si no están activados, reanude la agitación y compruebe con más frecuencia hasta que se logre una activación del 90%. Después de que los huevos se asienten en la parte inferior del vaso de precipitados, compruebe la eficiencia de activación.
Los huevos bien activados tienen aproximadamente el 25% del polo animal y el 75% del polo vegetal. A continuación, lavar los huevos dos veces con un volumen total de 50 mililitros de tampón de extracto complementado con inhibidores de la proteasa. Luego, transfiera cuidadosamente los huevos a un microtubo de tapa de presión de 0,4 mililitros.
Centrifugar el microtubo durante 60 segundos a 200 g y luego a 600 g durante 30 segundos para empacar los huevos. A continuación, utilice una pipeta Pasteur de vidrio para eliminar el exceso de tampón en la parte superior de los huevos después de cada paso. Después de esto, tritura los huevos a 15.000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.
Usa una cuchilla de afeitar para cortar los tubos para separar las tres capas de huevos triturados y mantener el citoplasma crudo en la capa media. A continuación, transfiera el citoplasma crudo para limpiar los tubos de ultracentrífuga. Complementar el citoplasma con inhibidores de la proteasa y citocaplasina B a 10 microgramos por mililitro cada uno.
Centrifugar el citoplasma crudo a 15.000 g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Luego, usa una cuchilla de afeitar para cortar el tubo y mantener el citoplasma en la capa media. Coloque los extractos recién preparados sobre hielo.
En primer lugar, agregue el ARNm securin-mCherry a los extractos preparados. A continuación, añada 200 microlitros de 2%fluorosurfactante PFPE-PEG a la mezcla de ARNm de extracto. Utilice un mezclador de vórtice para generar gotas, ajustando la velocidad del vórtice y la duración según sea necesario.
A continuación, inspeccione visualmente las gotas para asegurarse de que son uniformes en tamaño. Usando una pipeta de 200 microlitros, transfiera las gotas flotando en la parte superior y un volumen igual de surfactante a un tubo pcR. Sumerja un tubo de vidrio en la capa de gotas y espere hasta que las gotas llenen aproximadamente el 75% del tubo.
A continuación, empuje el tubo en la capa de surfactante, y llene el tubo por completo. A continuación, llene un plato con fondo de cristal con aceite mineral. Luego, usa pinzas finas para sumergir el tubo lleno de gotas en el aceite.
Utilice una pipeta de vidrio para eliminar los restos visibles o las gotas con fugas. Para evitar el movimiento y la fuga de gotas, el tubo de vidrio lleno de gotas debe sumergirse debajo del aceite mineral con cuidado. Podemos empujar el tubo en ambos extremos con equilibrio o añadir unas gotas de aceite mineral en los extremos del tubo simultáneamente primero.
Después de esto, utilice un microscopio de epifluorescencia equipado con una etapa xy motorizada para tomar imágenes de las gotas. Graba vídeos de lapso de tiempo en el campo brillante y múltiples canales de fluorescencia cada seis a nueve minutos hasta que las gotas pierdan su actividad. Usando este protocolo, se produjo una oscilación mitótica tanto en células simples y libres de energía nuclear como en células complicadas con núcleos.
Las gotas libres de núcleos generaron oscilación mitótica de hasta 30 ciclos sin amortiguar durante 92 horas. También se examinó la capacidad del oscilador mitótico para conducir eventos mitóticos aguas abajo. El oscilador mitótico autosostenido impulsó los cambios de morfología nuclear observados a través de la alteración autónoma de distintas fases del ciclo celular.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar tener en cuenta el momento en que se hace el extracto, ya que es sensible al tiempo, y siempre mantener los huevos y extraer en hielo. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología del sistema exploraran los principios fundamentales de las propiedades complejas del reloj, como la tunabilidad y la estocástica en Xenopus laevis.
