Este método puede ayudar a abordar cuestiones clave en neurobiología, como la polaridad de las neuronas motoras, la orientación de axón, el tráfico de axones y los mecanismos neurodegenerativos. La principal ventaja de esta técnica es obtener un cultivo de neuronas motoras altamente enriquecido mientras tomamos para expresar nuestra proteína knockdown por minuto de afecto. Para comenzar este procedimiento, coloque un embrión en un plato de medios de disección codificados con silicio.
Bajo el microscopio, sostenga el embrión con el abdomen contra el silicio con fórceps. Con el segundo par de fórceps, inserte una de las puntas en el canal central de la médula espinal rostrad. Luego, cierre los fórceps para desgarrar ligeramente el tejido dorsal.
Repita esta operación hacia el lado de la connell hasta que se abra toda la médula espinal. A continuación, coloque el embrión de modo que la médula espinal abierta esté contra el silicio. Posteriormente, separar la parte rostrad de la médula espinal del cuerpo.
Pinche la parte rostrad de la médula espinal y tire del embrión por la cabeza para extraer la médula espinal. Retire con cuidado las meninges y los DRG restantes que aún estén unidos a la médula espinal. Aplanar la médula espinal en el silicio y usando un bisturí, retire la mitad dorsal de la cuerda cortando a lo largo de la mitad de cada lado.
Corta la parte central en diez pedazos y transfiéralos a un tubo nuevo. Para preparar la suspensión celular de las médulas espinales, recoja las piezas de la médula espinal en la parte inferior del tubo. Sustituya HBSS por un mililitro de jamón F-10 medio y añada diez microlitros de trippsina.
Incubar el tubo durante diez minutos a 37 grados centígrados. Para detener la digestión enzimática, transfiera los fragmentos a un nuevo tubo de 15 mililitros, que contiene 800 microlitros de medio L-15 completo, 100 microlitros de 4%BSA, y 100 microlitros de DNAs y valorría, dos veces. Deje que los fragmentos se asienten durante dos minutos antes de recoger el sobrenadante en un tubo fresco de 15 mililitros.
Añadir suavemente dos mililitros de 4%BSA en la parte inferior del tubo de sobrenadante. Centro fusible a 470 x gravedad durante 5 minutos. Después de 5 minutos, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el palé celular con 2 mililitros de medio L-15 completo.
Para el enriquecimiento de motoneurón, divida la suspensión celular en dos tubos de 15 mililitros. A continuación, añada dos mililitros de medio L-15 PH a cada tubo. Si comienza con seis embriones, utilice el equivalente a tres embriones por tubo y tres mililitros de medio.
Añadir lentamente 2 mililitros de solución de gradiencia de densidad, en la parte inferior de cada tubo para obtener una interfaz nítida. A continuación, centro de fusible a 830 x gravedad durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de este paso, las células pequeñas deben estar en la parte inferior del tubo, mientras que las células grandes, como la motoneuron, deben estar en la solución de gradiente de densidad/interfaz media.
Asperae 1 a 2 mililitros de las células en la interfaz y transferirlos a un tubo fresco de 15 mililitros. Ajuste el volumen a diez mililitros con medio L-15 PH. Posteriormente, agregue dos mililitros del cojín 4%BSA en la parte inferior de los dos tubos.
Y el fusible centro a 470 x gravedad durante 5 minutos a temperatura ambiente. Después de 5 minutos, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el palet y 3 mililitros del medio L-15 completo. Repita la centrifugación a 470 x gravedad durante 5 minutos a temperatura ambiente.
A continuación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el palé de celda y dos mililitros de medio de cultivo completo. Para cultivar neuronas motoras, diluirlas a 5.000-10.000 células en 500 microlitros de medio de cultivo por pozo en una placa de 24 pozos. A continuación, retire la solución de láminas con la punta de la pipeta P-1, 000.
Transfiera inmediatamente las neuronas motoras diluidas en medio de cultivo. a las placas de codificación para evitar el secado. Para preparar el ADN, vuelva a suspender 1 microgramo de ADN en 50 microlitros del medio de cultivo neuronal.
Y vórtice durante 5 segundos. Para preparar el tubo B, vuelva a suspender 1,5 microlitros de cuentas en 50 microlitros de medio de cultivo neuronal. Añadir 50 microlitros de solución de perlas a 50 microlitros de solución de ADN e incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente.
Durante esta incubación, retire 100 microlitros del medio de cultivo del pozo que será trans infectado. Posteriormente, transfiera 100 microlitros de la mezcla de cuentas de ADN a cada pozo. Y incubar la placa de 24 pozos, 20-30 minutos en la placa magnética a 37 grados Celsius.
Aquí se muestra, es la morfología de la neurona del módem revelada por la posición de la cadena pesada de neurofilamento endógeno no fosforilado después de cuatro días de cultivo. En estas imágenes, muestre la morfología de la neurona del módem después de cuatro días in vitro y trans infectado para el gen trans EGFP por magnetofección en el segundo día. Las neuronas lema fueron contratenidas con el marcador SMI-32 o el marcador pan-neuro TUJ-1 y las flechas indican el soma de las neuronas.
Estas son sus imágenes confocales de neuronas motoras infectadas por magneto, expresando construcciones EGFP NEFH de tipo salvaje o mutante y manchadas por su marcador autofágico LC-3B. Las flechas muestran los agregados de proteínas NEFH EGFP mutantes que también son LC-3B positivos Después de este procedimiento, montoholda curcha puede ser analizado por microscopía de video para visualizar el tráfico de axones y agregar alguna orientación. Después de su desarrollo inicial para abordar cuestiones fundamentales en biología neuronal, esta técnica también demuestra ser una poderosa herramienta para explorar mecanismos fisiopatológicos que implican el espectro de trastornos de motoneuron, como la enfermedad del síndrome de shock tóxico, la esclerosis lateral trófica samuel, o la atrofia muscular espinal.
