Name: preparation of drosophila larval samples for gas chromatography-mass spectrometry (gc-ms)-based metabolomics
Uploaded: 2018-06-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry GC-MS-based Metabolomics at JoVE.com

Gracias a los miembros de la Indiana Universidad masa espectroscopia y la Universidad de Utah metabolómica base para ayuda en la optimización de este protocolo. J.M.T. es apoyado por el Instituto Nacional de General médica Ciencias de los institutos nacionales de salud bajo la concesión número R35GM119557.

1. huevo de colección
<ol><li>Recoger los machos adultos y hembras vírgenes de los genotipos deseados. Individualmente la edad estos animales en un frasco de comida con medios estándar de Bloomington durante 3 – 5 días.</li>
	<li>Configurar los apareamientos adecuados mediante la transferencia de 25 machos y 50 hembras vírgenes a un nuevo frasco de alimento. Nota: Un mínimo de seis acoplamientos independientes se debe establecer para cada genotipo. Se recogerán sólo una muestra de cada apareamiento (es decir, seis muestras de seis acoplamientos independientes).</li>
	<li>
Preparar tapas de melaza puesta de huevos.
	<ol>
<li>115 mL de melaza y 29 g de agar con 700 mL de H2O en un matraz de 2 L de la mezcla.</li>
		<li>Hervir la melaza mezcla de agar en una placa caliente.</li>
		<li>Enfriar a 70 ° C.</li>
		<li>Añadir 25 mL de mezcla ácida (20 mL de ácido fosfórico 85% y el ácido propiónico 209 mL en 1 L de H2O; Almacene en una botella marrón) y 10 mL de éster del ácido p-hidroxi-benzoico metil 10% en etanol al 95%.</li>
		<li>Verter el agar melaza en parte de la tapa y el fondo de un plato de cultivo de tejidos de 35 x 10 mm2 . Nota: Antes de verter la melaza placas de agar, asegúrese de que las tapas y/o de la base de la placa de 35 x 10 mm2 ajustarse perfectamente en la boca de una botella de stock de Drosophila (descrita en paso 1.6). Dependiendo de la marca de placas usadas, la base podría no ser utilizable.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Activar la levadura fresca pasta añadiendo agua destilada a la levadura seca (5 g levadura/7 mL de agua) hasta que la mezcla se convierte en una pasta que se puede propagar fácilmente sobre una superficie sólida (es decir, la consistencia de la mantequilla de maní).</li>
	<li>Se separó aproximadamente 1,5 g de levadura de pasta en la superficie de una tapa de melaza puesta de huevos.</li>
	<li>Meter cuatro agujeros de aire en lados opuestos de un plástico 6 onzas Drosophila stock botella utilizando una aguja de 22 G.</li>
	<li>Transferir las moscas recién fecundadas del frasco de comida en frascos de cultivo. Nota: Moscas pueden ser transferidas ya sea por uso de CO2 como un anestésico temporal o sujetando la parte superior del frasco en la boca de la botella y golpeando fuertemente el fondo de la botella contra un banco.</li>
	<li>Rápidamente Coloque un casquillo de puesta de huevos de melaza con pasta de levadura en la superficie en la boca de una botella de stock de Drosophila . Utilice cinta de laboratorio para asegurar la tapa puesta de huevos en el lugar. Nota: Si moscas fueron anestesiados antes de la transferencia, la botella debe colocarse horizontalmente en el Banco hasta que se han recuperado todas moscas. Una vez que las moscas son totalmente móviles, coloque la botella en una incubadora con la tapa puesta de huevos de melaza en la parte inferior de la cultura.</li>
	<li>Vuelva a colocar el tapón de puesta de huevos de melaza por lo menos una vez al día durante los primeros dos días invirtiendo la botella de stock, golpeando el fondo de la botella contra la mesa, quitar la tapa de huevo viejo e inmediatamente colocar una nueva tapa de huevo en la boca de la botella. Deseche la vieja gorra de puesta de huevos. Nota: Este paso garantiza que las hembras no tienen sus huevos y permite la colección de poblaciones sincronizadas.</li>
	<li>Coloque una tapa nueva puesta de huevos dentro de la botella de stock después de día 3, reemplazar después de 2 h y deseche. Quite y vuelva a colocar la segunda tapa de puesta de huevos después de cuatro horas. Etiqueta de la parte inferior de este tapón de puesta de huevos con la fecha, la hora y el genotipo. Nota: Los huevos recogidos durante esta ventana de 4 h se utilizará para el análisis. Este paso de sincronización es crítica para el análisis de etapas de desarrollo específicas. Huevos pueden recogerse de este modo durante varios días.</li>
	<li>Inserte los tapones de puesta de huevos en una placa de Petri 60 x 15 mm2 y coloque en una incubadora a la temperatura y la humedad.</li>
	<li>Inspeccione las tapas de puesta de huevos cada día por problemas de hambre, densidad de población o contaminación. Nota: Las larvas deben tener acceso a una alimentación adecuada para garantizar su desarrollo continuo. Si es necesario, pasta de levadura fresca se puede transmitir en todas las tapas de puesta de huevos que se utilizarán en el experimento. Además, si la densidad de población de larvas es muy alta, las larvas comenzará a pasear fuera de la placa de cultivo. Estas muestras no deben utilizarse para análisis metabolómicos debido a la alta densidad de población y peleas intermedias de hambre experimentado mientras vaga resultará en datos incoherentes. Una densidad de ~ 80 – 100 medio segundo instar larvas (L2) por placa o 40 – 50 medio larvas de tercer estadio (L3) por placa es recomendable. Deben descartarse las muestras que están visiblemente contaminadas con bacterias u hongos.</li>
</ol>2. larvas de muestrario
<ol><li>Larvas de edad hasta la etapa deseada. Si recoger larvas L3, volver a sincronizar las muestras en la muda de L2 – L3. Resincronización comúnmente se logra utilizando el método anteriormente descrito que utiliza los espiráculos anteriores como un hito del desarrollo15. Como alternativa, mid L3 larvas pueden sincronizarse usando un sgs3 reportero gene16. Nota: en este sentido, nos encontramos con larvas de mediados-L2 (~ 60 h después de la puesta de huevos) son ideales para la mayoría de los análisis porque en este momento es todavía relativamente sincrónico desarrollo larvario, las muestras cuidadosamente recogidas tienen una alimentación adecuada para desarrollar este punto y la número de animales por ejemplo es manejable (véase abajo). Un paso de sincronización adicional es necesario para las larvas L3 debido a los numerosos pulsos de ecdisona que ocurren durante el desarrollo de L3 tienen efectos dramáticos sobre el metabolismo y la generación de artefactos en poblaciones fuera de sincronización.</li>
	<li>Utilice una aguja de disección para levantar suavemente la pasta de levadura de la agar. Coloque la levadura en una tapa nueva de agar melaza. Nota: La mayoría de las larvas se comen en la interfase entre el agar melaza y la pasta de levadura.</li>
	<li>Utilice un pequeño pincel para recolectar larvas de la superficie recién expuesta del agar melaza. Coloque las larvas en un tubo de centrífuga de 1.5 mL en hielo. Nota: Tamaños de muestra adecuados para cada etapa del desarrollo son los siguientes: 50 primer instar las larvas (L1); 25 larvas de mediados-L2; larvas L3 tempranas 20; 15 mid L3 o larvas L3 finales.</li>
	<li>Lavar y congelar las muestras (pasos de 2.3 a 2.8) en lotes pequeños (4 a 6 muestras) mientras que recoge un conjunto de muestras grandes. Las muestras deben congelarse a 20 min de colocar las larvas en tubos. Nota: Recomendamos usar tubos Eppendorf 1,5 mL Flex porque otros tubos pueden interferir con la transferencia de la muestra en el paso 3. Las muestras deben recogerse en tubos de microcentrífuga. No recoja muestras en los tubos de cuentas descritos en el paso 3.1. Granos de cerámica conservan la solución de lavado NaCl, que resulta en mediciones inexactas de masa e introduce contaminantes en la muestra.</li>
	<li>Añadir 1 mL de helado 0.9% NaCl en el tubo, cierre la tapa y voltear verticalmente el tubo a bien para lavar las larvas.</li>
	<li>Coloque el tubo en hielo por 30 ~ s. Durante este tiempo, las larvas se hundirán hasta el fondo del tubo, pero levadura permanecerá en suspensión. Una vez que todas las larvas han formado un pellets sueltos, retirar la solución de NaCl con una pipeta de 1 mL.</li>
	<li>Repita el paso 2.4 y 2.5 de paso dos veces, o hasta que la solución de lavado final es claro. Nota: Los pasos de lavado adicional pueden ser necesarios si la muestra recogida contiene una cantidad excesiva de levadura.</li>
	<li>Centrifugar las muestras a 2.000 × g durante 1 min a 4 ° C.</li>
	<li>Retire todo resto de solución con una pipeta de 200 μl.</li>
	<li>Congelar inmediatamente la muestra en nitrógeno líquido. Nota: El protocolo se puede detener en este paso. Las muestras pueden almacenarse hasta por 3 meses a-80 ° C.</li>
</ol>3. transferencia de muestras a tubos de grano
<ol><li>Cada muestra de larvas debe ser transferido desde el tubo de microcentrífuga de 1,5 mL a un tubos de ciegas de 2 mL que contiene granos de cerámica 1,4 mm. En preparación para esta etapa de transferencia, utilice un marcador a prueba de etanol para etiquetar al lado de un tubo de 2 mL ciegas grano (marcas en la tapa se destruirán durante el paso 4.4).</li>
	<li>Tara la masa del tubo etiquetado grano utilizando una balanza analítica capaz de medir con precisión de 0.01 mg.</li>
	<li>Si muestras larvarias fueron almacenadas a-80 ° C, colocar tubos en antes de nitrógeno líquido para transferir.</li>
	<li>Utilice pinzas largas para quitar el tubo de muestra de 1,5 mL de nitrógeno líquido dewar.</li>
	<li>Usando guantes de nitrilo, agarrar el congelado tubo, invertir y libra fuertemente la tapa del tubo contra la mesa para desalojar a los pellets congelados. Inmediatamente Vierta el sedimento en un tubo de bolas ciegas 2 mL previamente tarado. Si el precipitado no desalojar, regresar el tubo al nitrógeno líquido y repita. Nota: Perdigones larvas no se expulse de todos los tubos de microcentrífuga. Si mediante un tubo que no sea el recomendado, determinar si retirar larvas pellets antes de recoger muestras para análisis.</li>
	<li>Medir rápidamente la masa combinada del tubo larval de pellet y grano. Coloque inmediatamente el tubo de la muestra en nitrógeno líquido. La pelotilla larvas masa servirá para normalizar los datos metabolómicos. Nota: El protocolo se puede detener en este paso. Las muestras pueden almacenarse hasta por 3 meses a-80 ° C.</li>
</ol>4. extracción de la muestra
<ol><li>Colocar los tubos de muestra en un trabajo de-20 ° C más frío.</li>
	<li>Agregar 0,8 mL de prechilled (-20 ° C) 90% metanol que contiene ácido succínico-d4 de 2 μg/mL en cada tubo. Retomar la muestra el trabajo de-20 ° C más frío. Nota: El ácido succínico-d4 sirve como estándar interno. Utilice sólo HPLC grado H2O y metanol. Metanol y otros disolventes orgánicos son volátiles y difíciles de medir con precisión utilizando pipetas de desplazamiento de aire, se recomienda utilizar pipetas de desplazamiento positivo para este paso y todos los pasos siguientes.</li>
	<li>Establecer un control negativo por agregar 0,8 mL de prechilled (-20 ° C) 90% metanol que contiene ácido succínico-d4 de 2 μg/mL en un tubo de vacío del grano.</li>
	<li>Homogeneizar las muestras durante 30 segundos a 6.45 m/s utilizando un homogeneizador de molino de grano en una sala de control de temperatura de 4 ° C. Nota: Falta rápidamente y completamente homogeneizar el sedimento larval es una fuente común de variabilidad en el análisis de la metabolómica. Sólo utilizar homogeneizadores que son capaces de destruir congelado el tejido larval dentro de los 30 s.</li>
	<li>Retomar los tubos de las muestras homogeneizadas del benchtop de-20 ° C más frío e incubar en un congelador de-20 ° C durante al menos 1 h.</li>
	<li>Centrifugar los tubos a 20.000 × g o máxima velocidad durante 5 minutos a 4 ° C para eliminar el precipitado resultante.</li>
	<li>Transferir 600 μl del sobrenadante a un tubo nuevo de microcentrífuga de 1,5 mL. No molestar el precipitado. Si el sedimento precipitado se desaloja al pipetear el sobrenadante, volver todos sobrenadante en el tubo y repita el paso 4.6.</li>
	<li>Colocar los tubos de muestra en una centrífuga de vacío. Asegúrese de que todos los tubos están abiertos antes de sellar la centrifugadora. Secar las muestras a temperatura ambiente hasta que se quite todo solvente (este paso suele ~ 16 h para completar). Nota: Si es necesario, el protocolo puede hacer una pausa en este paso. Muestra seca puede almacenarse a-80 ° C.</li>
</ol>5. química derivatización
<ol><li>Si las muestras secas fueron almacenadas a-80 ° C, coloque tubos sin abrir en una centrífuga de vacío y secar durante 30 minutos. Este paso debe realizarse antes de abrir el tubo de muestra. Nota: Este paso elimina la condensación que se acumula en el exterior del tubo de microcentrífuga Cuando retira del congelador. Esta parte del protocolo es extremadamente sensible a H2O y precaución adicional se debe mantener los reactivos tan secas como sea posible.</li>
	<li>
Preparar una solución de clorhidrato de methoxylamine de 40 mg/mL (MOX) en piridina anhidra. Sólo utilizar piridina anhidra. Guarde los MOX y piridina en un desecador y preparar diariamente la solución MOX. PRECAUCIÓN: MOX y piridina son tóxicos. Preparar esta solución en la campana.<ol>
<li>Use una pistola de calor para secar una jeringa de vidrio de 1 mL.</li>
		<li>Inserte la aguja de la jeringa en el frasco de la piridina anhidra. Retirar 1 mL de piridina y añadir a un tubo de microcentrífuga que contiene 40 mg de MOX.</li>
		<li>Enjuagar la botella de la piridina anhidra con argón. Sello de la botella y volver en el desecador.</li>
		<li>Disolver el MOX en la piridina por incubando el tubo en un mezclador termal a 35 ° C durante 10 minutos a 600 rpm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Agregar 40 μl de MOX de 40 mg/mL en solución de piridina anhidra a la muestra seca.</li>
	<li>Vortex de 10 s y brevemente centrífuga (10.000 x g durante 20 s).</li>
	<li>Incubar a 30 ° C por 1 h a 600 rpm en un mezclador térmico.</li>
	<li>Centrifugue a 20.000 x g o velocidad máxima durante 5 minutos eliminar las partículas.</li>
	<li>Transferencia 25 μl del sobrenadante en un frasco muestreador automático con un inserto de microvolume de vidrio de 250 μl desactivado.</li>
	<li>Agregar 40 μl de N- metil -N- trimethylsilyltrifluoracetamide (MSTFA) que contiene 1% TMCS. PRECAUCIÓN: MSTFA es tóxico. Realizar este paso en la campana. Nota: Si está disponible, este paso puede ser completado por un automuestreador de Gerstel.</li>
	<li>Coloque una tapa en el frasco muestreador y sellar usando una herramienta de prensado.</li>
	<li>Incubar la muestra a 37 ° C durante 1 hora con agitación (250 rpm).</li>
	<li>Preparar un ácido graso metil ester (famas) solución como anteriormente desceribed3. Agregar 3 μl de famas para el frasco muestreador automático utilizando un muestreador automático robótica inmediatamente antes de la inyección. Nota: Famas se utilizan para calibrar el cambio de tiempo de retención y compruebe el funcionamiento del instrumento. Si no se dispone de ningún muestreador automático robótico, FAMAS pueden agregarse durante paso 5.8.</li>
</ol>6. detección de GC-MS de
Nota: En la mayoría de los casos, el usuario llevará a cabo este paso con la ayuda de una instalación de base de espectrometría de masas. Este protocolo está diseñado para ser utilizado con una columna de GC con una precolumna de 5 m de 30 m.
<ol><li>Aleatorizar el orden de la muestra.</li>
	<li>
Preparar el GC-MS.
	<ol>
<li>Conjunto la tasa de flujo de gas de helio portador a 1 mL/min.</li>
		<li>Ajustar la temperatura de entrada a 250 ° C.</li>
		<li>Programa de la GC para ejecutar el siguiente gradiente de temperatura:<ol>
<li>Temperatura inicial a 95 ° C con una espera de 1 minuto.</li>
			<li>Aumentar la temperatura a 110 ° C a una velocidad de 40 ° C/min con una espera de 2 minutos.</li>
			<li>Aumentar a 250 ° C 5° C/min rampa.</li>
			<li>Aumentar a 330 ° C a una velocidad de 25 ° C/min con una mano final de 4 minutos.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Programe un retraso de solvente a 3,5 min. Nota: Puede cambiar la hora según el sistema de GC-MS. El propósito de este paso es evitar MSTFA y MOX dañe el detector.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inyectar 1 μl de la muestra derivatizada en GC-MS (split proporción 10:1). Nota: Inyecte 2 μl de la muestra si la intensidad de los picos es demasiado baja. El orden de inyección de muestras debe ser al azar.</li>
	<li>Operar el espectrómetro de masas en el modo de exploración completa en un rango de masas de 50 a 500 m/z.</li>
</ol>7. Análisis de datos
<ol><li>Analizar datos metabolómicos utilizando ya sea un enfoque objetivo o no focalizado. Análisis objetivo se centra en medir la abundancia de un conjunto definido de metabolitos, como las mediciones de lactato que describimos a continuación. En contraste, el análisis no focalizado utiliza un enfoque imparcial para identificar cualquier característica metabólica que es cambiado de forma significativa entre dos conjuntos de la muestra. Nota: Nuestro laboratorio utiliza principalmente los programas gratis MetAlign17 y18,de MetaboAnalyst19 para análisis de datos. Puesto que una descripción adecuada de la control de calidad, normalización y pasos de procesamiento de datos fuera del alcance de este manuscrito, nos referimos al usuario a protocolos más detallados que se dedican al procesamiento de datos20,21, 22. Además, un diagrama de flujo que describe los pasos necesarios para este análisis se puede encontrar en otra parte8.</li>
</ol>

<ol>
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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+the+metabolic+basis+of+Drosophila+development.">Methods for studying the metabolic basis of Drosophila development.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 6 (5), (2017).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Metabolómica proporciona una oportunidad sin precedentes para estudiar las reacciones metabólicas que componen el metabolismo intermediario. La sensibilidad de esta tecnología, sin embargo, procesa datos susceptibles a fondo genético, claves del desarrollo y una variedad de tensiones ambientales, como temperatura, humedad, densidad de población y la disponibilidad de nutrientes. Por lo tanto, una alta calidad y reproducible metabolómica análisis requiere que las muestras se recogerán bajo condiciones altamente co...

La mosca de la fruta Drosophila melanogaster se ha convertido en un sistema ideal para estudiar el mecanismo molecular que regula el metabolismo intermediario. No se conservan más rutas metabólicas entre Drosophila y los seres humanos sólo sensores de nutrientes claves y reguladores del crecimiento, tales como insulina, Tor y myc, que también son activos en la mosca1,2. Como resultado, Drosophila puede utilizarse para explorar la base metabólica de enfermedades humanas que van desde la diabetes y la obesidad a cáncer y la neurodegeneración. En este sentido, el desarrollo larvario de Drosophila proporciona el marco ideal estudiar un programa metabólico conocido como glucólisis aeróbica, o el efecto de Warburg. Como muchos tumores utilizan glucólisis aeróbica para generar biomasa de hidratos de carbono, así que para hacer Drosophila larvas activan glucólisis aeróbica para promover el crecimiento del desarrollo3,4,5. Estas similitudes entre larvas y tumor metabolismo establecer Drosophila como un modelo clave para entender cómo aeróbico glucólisis es regulada en vivo.
A pesar de que la mosca se ha convertido en un modelo popular para el estudio de metabolismo, mayoría de Drosophila los estudios dependen de los métodos que están diseñados para medir los metabolitos3, como la trehalosa, triglicéridos o ATP. Puesto que se requiere un protocolo específico para medir cada metabolito, estudios basados en análisis son mano de obra intensiva, caros y sesgada hacia los compuestos que se pueden medir utilizando kits comerciales. Una solución a estas limitaciones ha surgido desde el campo de la metabolómica, que proporciona un medio más eficaz e imparcial estudio de metabolismo de Drosophila . A diferencia de un estudio basado en el análisis, un análisis metabolómicos solo puede medir cientos de metabolitos de molécula pequeña y simultáneamente proporcionar una comprensión global de estado metabólico6,7 de un organismo. Esta técnica ha ampliado considerablemente el alcance de los estudios metabólicos de Drosophila y representa el futuro de este emergente campo8.
Estudios metabolómicos se realizan principalmente utilizando tres tecnologías: (i) resonancia magnética nuclear (RMN), (ii) líquida cromatografía-espectrometría de masas (LC-MS) y (iii) cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS)9. Cada enfoque ofrece ventajas y desventajas, y todas estas tecnologías se han utilizado para estudiar con éxito metabolismo de Drosophila . Puesto que las investigaciones realizadas en nuestro laboratorio se centra en metabolitos polares, pequeñas, principalmente empleamos un método GC-MS-basado. GC-MS proporciona al usuario con un número de ventajas, como alta reproducibilidad, máxima resolución, sensibilidad, y la disponibilidad de una biblioteca de espectros de impacto (EI) de electrón estándar, permite la identificación rápida de descubrieron el metabólico características10,11. La preparación de muestras para GC-MS, sin embargo, es algo compleja y requiere una atención cuidadosa al detalle. Muestras y deben realizarse, lavadas, pesadas, congeladas en una manera que sacia rápidamente reacciones metabólicas. Además, el cadáver de mosca es resistente a los protocolos estándar de la homogeneización y requiere un molino de grano para extracción del metabolito óptima. Por último, las muestras analizadas por GC-MS deben someterse a derivatización química antes de detección12. Mientras que métodos previamente publicados describen todos estos pasos3,13,14, todavía es necesario un protocolo visual que permita al usuario principiante reproducible generar datos de alta calidad. Aquí demostramos cómo preparar muestras de larvas de Drosophila para análisis metabolómica basada en GC-MS. Este protocolo permite al usuario medir reproducible muchos de los pequeños metabolitos polares que componen el metabolismo central de carbono.

<table><tbody><tr><td>Unsulfured blackstrap molasses</td><td>Good Food, INC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Agar Type II</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-103</td><td></td></tr><tr><td>Pyridine</td><td>EMD Millipore</td><td>PX2012-7</td><td></td></tr><tr><td>Methoxyamine hydrocholoride (MOX)</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>155405</td><td></td></tr><tr><td>MSTFA with 1% trimethylchlorosilane</td><td>Sigma</td><td>69478</td><td></td></tr><tr><td>Fleischmann&amp;rsquo;s Active dry yeast</td><td>AB Mauri Food Inc</td><td>2192</td><td></td></tr><tr><td>6oz Drosophila stock bottle</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-130</td><td></td></tr><tr><td>Soft tissue homogenizing mix (2 mL tubes)&amp;nbsp;</td><td>Omni International</td><td>SKU:19-627</td><td></td></tr><tr><td>Vial insert, 250 &amp;micro;L deactivated glass with polymer feet</td><td>Agilent</td><td>5181-8872</td><td></td></tr><tr><td>Succinic acid-2,2,3,3-d&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>293075</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Thermo&amp;nbsp;</td><td>SC210A</td><td></td></tr><tr><td>o-Phosphoric acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A242-1</td><td></td></tr><tr><td>Propionic acid</td><td>Sigma</td><td>P5561</td><td></td></tr><tr><td>p-Hydroxy benzoic acid methyl ester</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-258</td><td></td></tr><tr><td>Bead Ruptor</td><td>Omni International</td><td>SKU:19-040E</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer F1.5</td><td>Eppendorf</td><td>5384000012</td><td></td></tr><tr><td>MultiTherm Shaker with a 24 X 12 mm block</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H5000</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL centrifuge tube</td><td>Eppendorf</td><td>22364111</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35 X 10 mm tissue culture dish</td><td>Corning Incorporated</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>GC column</td><td>Phenomex</td><td>ZB-5MSi</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of drosophila larval samples for gas chromatography-mass spectrometry (gc-ms)-based metabolomics

Los avances recientes en el campo de la metabolómica han establecido la mosca de la fruta Drosophila melanogaster como modelo genético poderoso para el estudio de metabolismo de los animales. Combinando la amplia gama de herramientas genéticas Drosophila con la capacidad para examinar grandes áreas del metabolismo intermediario, una aproximación metabolómica puede revelar las interacciones complejas entre dieta, genotipo, eventos de la historia de vida y señales ambientales. Además, estudios de metabolómica pueden descubrir nuevos mecanismos enzimáticos y descubrir conexiones previamente desconocidas entre vías metabólicas aparentemente dispares. Para facilitar el uso más generalizado de esta tecnología entre la comunidad de Drosophila , aquí proporcionamos un protocolo detallado que describe cómo preparar muestras de larvas de Drosophila para cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS)- basado en análisis metabolómicos. Nuestro protocolo incluye descripciones de muestras larvarias, extracción del metabolito, derivatización química y análisis por GC-MS. Culminación exitosa de este protocolo permitirá a los usuarios medir la abundancia relativa de pequeños metabolitos polares, como aminoácidos, azúcares y ácidos orgánicos participan en la glucólisis y el ciclo TCA.

Lactato deshidrogenasa (dLDH) mutantes, que carecen de dLDH actividad4y controles emparejados genéticamente fueron recogidos como larvas de mediados-L2 y procesadas según protocolo descrito anteriormente. Comparación con controles, larvas mutantes exhiben cambios significativos en el lactato, piruvato y L-2-hydroxyglutarate4. Los espectros fueron adquiridos con un sistema Agilent GC6890-5973i MS. Un ejemplo de los espectros de GC...

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Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry GC-MS-based Metabolomics

Este protocolo describe cómo preparar larvas de Drosophila para análisis metabolómicos basadas en GC-MS.

Preparación de muestras de larvas de Drosophila para cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS)-base metabolómica

Recent advances in the field of metabolomics have established the fruit fly Drosophila melanogaster as a powerful genetic model for studying animal ...

preparation-drosophila-larval-samples-for-gas-chromatography-mass

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)-based Metabolomics

11.1K vistas.  Indiana University. Este protocolo describe cómo preparar larvas de Drosophila para análisis metabolómicos basadas en GC-MS.

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Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often compromise the lives of those who suffer from these complex diseases. Detecting mitochondrial metabolic changes is vital to the understanding of mitochondrial disorders and mitochondrial responses to pharmacological agents. Although mitochondrial metabolism is at the core of metabolic regulation, the detection of subtle changes in mitochondrial metabolism may be hindered by the overrepresentation of other cytosolic metabolites obtained using whole organism or whole tissue extractions. 
Here we describe an isolation method that detected pronounced mitochondrial metabolic changes in Drosophila that were distinct between whole-fly and mitochondrial enriched preparations. To illustrate the sensitivity of this method, we used a set of Drosophila harboring genetically diverse mitochondrial DNAs (mtDNA) and exposed them to the drug rapamycin. Using this method we showed that rapamycin modifies mitochondrial metabolism in a mitochondrial-genotype-dependent manner. However, these changes are much more distinct in metabolomics studies when metabolites were extracted from mitochondrial enriched fractions. In contrast, whole tissue extracts only detected metabolic changes mediated by the drug rapamycin independently of mtDNAs.

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Mitochondria play central roles in the regulation of metabolism and homeostasis. Subtle changes in mitochondrial metabolism that affect organismal physiology could be difficult to detect in whole organism metabolomics studies. Here we describe an isolation method that enhances the detection of subtle metabolic shifts in Drosophila melanogaster.

Preparación de mitocondriales enriquecidos fracciones de Análisis metabólico en<em&gt; Drosophila</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, organism development, and disease. It is often desirable to obtain PPI information using in vivo material, to gain the most natural and unbiased view of the interaction networks. The fruit fly Drosophila melanogaster is an excellent platform to study PPIs in vivo, and lends itself to straightforward approaches to isolating material for biochemical experiments. In particular, fruit fly embryos represent a convenient type of tissue to study PPIs, due to the ease of collecting animals at this developmental stage and the fact that the majority of proteins are expressed in embryogenesis, thus providing a relevant environment to reveal most PPIs. Here we present a protocol for collection of Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g), which is an ideal amount for a wide range of proteomic applications, including analysis of PPIs by affinity purification-mass spectrometry (AP-MS). We describe our designs for 1 L and 5 L cages for embryo collections that can be easily and inexpensively set up in any laboratory. We also provide a general protocol for embryo collection and protein extraction to generate lysates that can be directly used in downstream applications such as AP-MS. Our goal is to provide an accessible means for all researchers to carry out the analyses of PPIs in vivo.

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

The goal of this protocol is to provide a straightforward and inexpensive approach to collecting Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g) and preparing protein extracts that can be used in downstream proteomic applications, such as affinity purification-mass spectrometry (AP-MS).

Preparación a mediano plazo de<em&gt; Drosophila</em&gt; Extractos de embriones para experimentos proteómicos

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology, which all influence muscle development and myofibrillogenesis. Omics data, such as those generated by mass spectrometry or deep sequencing, can provide important mechanistic insights into these biological processes. For such approaches, it is beneficial to analyze tissue-specific samples to increase both selectivity and specificity of the omics fingerprints. Here we present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched muscle samples for omics applications. We first describe how to dissect flight muscles at early pupal stages (&#60;48 h after puparium formation [APF]), when the muscles are discernable by green fluorescent protein (GFP) labeling. We then describe how to dissect muscles from late pupae (&#62;48 h APF) or adults, when muscles are distinguishable under a dissecting microscope. The accompanying video protocol will make these technically demanding dissections more widely accessible to the muscle and Drosophila research communities. For RNA applications, we assay the quantity and quality of RNA that can be isolated at different time points and with different approaches. We further show that Bruno1 (Bru1) is necessary for a temporal shift in myosin heavy chain (Mhc) splicing, demonstrating that dissected muscles can be used for mRNA-Seq, mass spectrometry, and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) applications. This dissection protocol will help promote tissue-specific omics analyses and can be generally applied to study multiple biological aspects of myogenesis.

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology. We present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched samples ideal for proteomics and deep-sequencing. These samples can offer important mechanistic insights into diverse aspects of muscle development.

Disección de los músculos de vuelo de Drosophila melanogaster para los enfoques de Omics

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

Genética

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

Apetitivo aprendizaje asociativo olfativa en<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Neurociencias

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and behavioral evolution. Drosophila olfactory tissues house the olfactory receptor neurons (ORNs) that detect volatile chemical cues in addition to hydro- and thermo-sensory neurons. In this protocol, we describe the dissection of developing peripheral olfactory tissue of the adult Drosophila species. We first describe how to stage and age Drosophila larvae, followed by the dissection of the antennal disc from early pupal stages, followed by the dissection of the antennae from mid-pupal stages and adults. We also show methods where preparations can be utilized in molecular techniques, such as the RNA extraction for qRT-PCR, RNAseq, or immunohistochemistry. These methods can also be applied to other Drosophila species after species-specific pupal development times are determined, and respective stages are calculated for appropriate aging.

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Here, we present a protocol to stage and dissect developing olfactory tissue from Drosophila species. The dissected tissue can later be used for molecular analyses, such as quantitative RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) or RNA sequencing (RNAseq), as well as in vivo analyses such as immunohistochemistry or in situ hybridization.

Preparación de desarrollar tejido olfatorio periférico para Molecular y el análisis de Immunohistochemical en Drosophila

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and ...

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, Drosophila research lacks popularity in developing countries, possibly due to the misinformed idea that establishing a lab and performing relevant experiments with such tiny insects is difficult and requires expensive, specialized apparatuses. Here, we describe how to build an affordable flylab to quantitatively analyze a myriad of behavioral parameters in D. melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We provide protocols to build in-house vial racks, courtship arenas, apparatuses for locomotor assays, etc., to be used for general fly maintenance and to perform behavioral experiments using adult flies and larvae. We also provide protocols on how to use more sophisticated systems, such as a high resolution oxygraph, to measure mitochondrial oxygen consumption in larval samples, and show its association with behavioral changes in the larvae upon the xenotopic expression of the mitochondrial alternative oxidase (AOX). AOX increases larval activity and mitochondrial leak respiration, and accelerates development at low temperatures, which is consistent with a thermogenic role for the enzyme. We hope these protocols will inspire researchers, especially from developing countries, to use Drosophila to easily combine behavior and mitochondrial metabolism data, which may lead to information on genes and/or environmental conditions that may also regulate human physiology and disease states.

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

We provide protocols for anyone with a "maker culture" mind to start building a flylab for quantitative analysis of a myriad of behavioral parameters in Drosophila melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We also describe a high resolution respirometry protocol using larvae to combine behavioral and mitochondrial metabolism data.

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, ...

Comportamiento

Analysis of Lipid Signaling in Drosophila Photoreceptors using Mass Spectrometry

The activation of phospholipase C&#946; (PLC&#946;) is an essential step during sensory transduction in Drosophila photoreceptors. PLC&#946; activity results in the hydrolysis of the membrane lipid phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate [PI(4,5)P2] leading ultimately to the activation of transient receptor potential (TRP) and TRP like (TRPL) channels. The activity of PLC&#946; also leads subsequently to the generation of many lipid species several of which have been proposed to play a role in TRP and TRPL activation. In addition, several classes of lipids have been proposed to play key roles in organizing the cell biology of photoreceptors to optimize signaling reactions for optimal sensory transduction. Historically, these discoveries have been driven by the ability to isolate Drosophila mutants for enzymes that control the levels of specific lipids and perform analysis of photoreceptor physiology in these mutants. More recently, powerful mass spectrometry methods for isolation and quantitative analysis of lipids with high sensitivity and specificity have been developed. These are particularly suited for use in Drosophila where lipid analysis is now possible from photoreceptors without the need for radionuclide labeling. In this article, the conceptual and practical considerations in the use of lipid mass spectrometry for the robust, sensitive, and accurate quantitative assessment of various signaling lipids in Drosophila photoreceptors are covered. Along with existing methods in molecular genetics and physiological analysis such lipid is likely to enhance the power of photoreceptors as a model system for discoveries in biology.

Analysis of Lipid Signaling in Drosophila Photoreceptors using Mass Spectrometry

The manuscript presents versatile, robust, and sensitive mass spectrometry protocols to identify and quantify several classes of lipids from Drosophila photoreceptors.

The activation of phospholipase C&#946; (PLC&#946;) is an essential step during sensory transduction in Drosophila photoreceptors. PLC&#946; activity ...

Bioquímica

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

Análisis metabólico del cerebro adulto y Larval de Drosophila melanogaster

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

Purificación de las transcripciones y los metabolitos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Cabezales

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Biología

Monitorización del transporte de metabolitos cerebrales en Drosophila mediante sensores FRET

Visualizing Monocarboxylates and Other Relevant Metabolites in the Ex Vivo Drosophila Larval Brain Using Genetically Encoded Sensors

The high energy requirements of brains due to electrical activity are one of their most distinguishing features. These requirements are met by the production of ATP from glucose and its metabolites, such as the monocarboxylates lactate and pyruvate. It is still unclear how this process is regulated or who the key players are, particularly in Drosophila.
Using genetically encoded F&#246;rster resonance energy transfer-based sensors, we present a simple method for measuring the transport of monocarboxylates and glucose in glial cells and neurons in an ex-vivo Drosophila larval brain preparation. The protocol describes how to dissect and adhere a larval brain expressing one of the sensors to a glass coverslip. 
We present the results of an entire experiment in which lactate transport was measured in larval brains by knocking down previously identified monocarboxylate transporters in glial cells. Furthermore, we demonstrate how to rapidly increase neuronal activity and track metabolite changes in the active brain. The described method, which provides all necessary information, can be used to analyze other Drosophila living tissues.

Autor destacado: Avances en la investigación del metabolismo energético cerebral utilizando el modelo de Drosophila

Here we present a protocol to visualize the transport of monocarboxylates, glucose, and ATP in glial cells and neurons using genetically encoded F&#246;rster resonance energy transfer-based sensors in an ex-vivo Drosophila larval brain preparation.

Visualización de monocarboxilatos y otros metabolitos relevantes en el cerebro de larvas de Drosophila ex vivo utilizando sensores codificados genéticamente

Preparación de muestras de larvas de Drosophila para cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS)-base metabolómica

Resumen

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Preparación de mitocondriales enriquecidos fracciones de Análisis metabólico en

Preparación a mediano plazo de

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Apetitivo aprendizaje asociativo olfativa en

Preparación de desarrollar tejido olfatorio periférico para Molecular y el análisis de Immunohistochemical en Drosophila

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

Analysis of Lipid Signaling in Drosophila Photoreceptors using Mass Spectrometry

Análisis metabólico del cerebro adulto y Larval de Drosophila melanogaster

Purificación de las transcripciones y los metabolitos de

Visualización de monocarboxilatos y otros metabolitos relevantes en el cerebro de larvas de Drosophila ex vivo utilizando sensores codificados genéticamente