Name: harvesting venom toxins from assassin bugs and other heteropteran insects
Uploaded: 2018-04-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Harvesting Venom Toxins from Assassin Bugs and Other Heteropteran Insects at JoVE.com

Reconocemos financieros de apoyo del Consejo australiano de investigación (becas DP130103813 y LP140100832 a G.F.K., DECRAN beca DE160101142 a EABU), el Australian National Health & Medical Research Council (beca de investigación Principal APP1044414 a G.F.K.) y la Universidad de Queensland (Beca Postdoctoral a A.A.W.).

Este protocolo cumple con la política de la Universidad de Queensland en el cuidado responsable y uso de animales en docencia e investigación (PPL 4.20.11) así como la Nacional de salud y de Consejo de investigación médica Código Australiano para el cuidado y uso de animales para fines científicos (8th edición 2013).
PRECAUCIÓN: tenga cuidado para no ser envenomated al manipular insectos asesinos. Tenga cuidado para proteger los ojos al manipular especies que escupen veneno defensivo. Tenga cuidado en no para herir a los animales experimentales. Esto incluye la monitorización de la presión sobre restricciones tales como gomas y asegurando que la probóscide no está rota.
Nota: Opcionalmente, anestesiar animales por la exposición a CO2 por 0.5-2 min o 4-10 ° c de enfriamiento antes de la cosecha de veneno en tiene como objetivo 1-3 para facilitar la transferencia segura y moderación. Para la anestesia no es estrictamente necesaria pero puede facilitar la sujeción segura de ejemplares ágiles y fuertes. Sin embargo, animales deben estar despiertos para permitir la recolección de veneno. Tener aplicaciones posteriores en cuenta al decidir si o no agregar inhibidores de la proteasa.
1. extracción de toxinas del veneno por electroestimulación
<ol><li>Obtener a especímenes vivos de que cosecha las toxinas.</li>
	<li>Pinzas plásticas preparadas de uso con los electrodos positivos y negativos montan en cada extremo. Conectar pinzas electrificadas a un electroestimulador o una fuente de tensión constante que permite el ajuste de la tensión.<ol>
<li>De pequeño (~ 10 mm) y grande (~ 25 m m) insectos de asesino, utilizar tensiones de pico de 15 y 25 V respectivamente.</li>
		<li>Para mayor heteropterans como chinches de agua gigantes, usar hasta 40 V.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Contener errores vivo por cercar a una plataforma, usando una banda elástica sobre el tórax.</li>
	<li>Coloque la punta de la probóscide en una punta de recogida adecuada. Insectos de asesino, utilice una punta de pipeta P200. Gigante chinches de agua, cortar la extremidad de una punta de P200 para aumentar el tamaño de la abertura.<ol>
<li>Suavemente Levante la probóscide con una pinzas limpiamos cerrado y empuje la abertura abierta de la punta de la colección sobre el final de la probóscide.</li>
		<li>Si lo desea, punta de agua ultrapura de absorción ~ 5 μl antes de colocar la probóscide en la recolección. Esto reduce las pérdidas de veneno restante dentro de la punta, aunque el veneno cosechado se diluirá.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aplicar electroestimulación. Sumergir los electrodos estimulantes en gel conductor, tales como 2, 5 M NaCl/50% glicerol. Aplique los electrodos en el tórax. Para belostomatids, aplicar los dos electrodos a la superficie dorsal posterior de la cabeza.</li>
	<li>Almacenar el veneno para evitar autodegradation. Después se saca el veneno, transferir rápidamente a un tubo a-20 ° C o -60 ° C, o un tubo que contiene el cóctel de inhibidor de la proteasa.</li>
	<li>Repita los pasos del 1.5 y 1.6 hasta que se adquiere la suficiente veneno o no hay veneno más próxima.</li>
</ol>2. extracción de toxinas del veneno por acoso
<ol><li>Preparar animales para cosechar el veneno y la punta de la probóscide en un vestíbulo de colección, como se describe en los subapartados 1.1 y 1.3-1.4.</li>
	<li>Si espontáneamente se saca veneno, vaya al paso 2.3. Si no, acosar a los animales tocándolo suavemente en las piernas, abdomen y antenas con pinzas hasta que se produce el veneno.</li>
	<li>Transferir rápidamente veneno a un tubo a-20 ° C o -60 ° C o un tubo que contiene inhibidor de la proteasa coctel, si lo desea.</li>
</ol>3. extracción de toxinas del veneno por el acoso de "Escupir" especie de veneno
<ol><li>Anestesiar o anestesie parcialmente, el insecto antes de sacar de su gabinete para evitar cualquier escupir defensiva prematura.</li>
	<li>Provocar la conducta de escupir veneno. Contienen y vuelva a colocar el insecto usando la tapa profunda de un estándar 90 x 16 mm plato de Petri. Sostenga la tapa ligeramente posterior y 1-4 cm por encima de los insectos para evitar que el vuelo. Mayoría de los insectos escupirá varias veces, a menudo en rápida sucesión. Asegúrese de que todo veneno es recogido en la parte inferior del plato.</li>
	<li>Recoger el veneno en la parte inferior de la caja Petri mediante enjuague con 10 μl de agua ultrapura. Transferir rápidamente a un tubo a-20 ° C o -60 ° C, o un tubo que contiene el cóctel de inhibidor de la proteasa.</li>
</ol>4. extracción de toxinas del veneno por la disección de la glándula
<ol><li>Sacrificio de animales. Muy anestesiar o matar animales con > 5 minutos de exposición al CO2. Tubo de puro CO2 directamente en los agujeros de aire de cerramiento de cubierta del animal.</li>
	<li>Insecto de PIN a la bandeja de disección. Insectos de asesino, disecar a través de la superficie ventral (4.3). Para chinches de agua gigantes, disecar a través de la superficie dorsal (4.4).</li>
	<li>Disección ventral<ol>
<li>Inserte las clavijas de tres en el abdomen posterior presionado el insecto sin pinchar las glándulas de veneno.</li>
		<li>Cortar una incisión de línea media corta en la superficie ventral del abdomen con un bisturí miniatura. Utilizar tijeras de miniatura para extender la incisión de línea media anterior a la cabeza, teniendo cuidado de cortar sólo el exoesqueleto y no dañar las estructuras internas.</li>
		<li>Para exponer las estructuras internas, hacer varios cortes laterales que se extienden desde la incisión de línea media hacia el lado del insecto. Entonces, el perno detrás cada aleta de exoesqueleto ventral para revelar las estructuras internas.</li>
		<li>Grandes insectos de asesino, hacer cuatro incisiones laterales, en el abdomen abdomen medio, anterior, entre las piernas primeras y segunda y delante de la primera etapa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Disección dorsal<ol>
<li>Quitar las alas cerca de la base. Inserte las clavijas de tres en el abdomen posterior presionado el insecto sin pinchar las glándulas de veneno.</li>
		<li>Cortar una incisión de línea media de la cabeza al abdomen con miniatura tijeras y bisturí, teniendo cuidado de cortar sólo el exoesqueleto y no dañar las estructuras internas.</li>
		<li>Fuerza aparte de las dos mitades del insecto. Colocar varios pernos lateralmente a lo largo de la longitud del insecto a salir de la cavidad interna expuesta.</li>
		<li>Quitar los músculos de vuelo con unas pinzas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inunde la bandeja de disección. Añadir PBS hasta que el fallo esté sumergido para permitir que las estructuras internas flotan para arriba y ser más fácilmente visualizado.</li>
	<li>Utilizando pinzas y tijeras micro, retire con cuidado conectivo y tejido nervioso y la tráquea. Las glándulas de veneno aparecen como alargado, estructuras translúcidas que se extiende a lo largo de cada lado del canal alimenticio.<ol>
<li>Identificar la glándula principal por su aspecto característico, con lóbulos anteriores y posteriores y los dos conductos en el hilio.</li>
		<li>Si lo desea, identificar la glándula accesoria trazando el conducto desde el hilio. Libre la glándula principal, cortando los dos conductos que emana desde el hilio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cosechar los lúmenes glándula deseada. Transferencia de la glándula en una microcentrífuga en hielo con 30 μl de PBS o PBS plus inhibidor de la proteasa cóctel. Lanza las glándulas con un alfiler limpio agudo.<ol>
<li>Vortex de 10 s y centrífuga (1 min, 5.000 × g, 4 º C) para vaciar los lúmenes de la glándula. Eliminar el tejido glandular con unas pinzas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aclarar el extracto de la toxina. Centrífuga (5 min, 17.000 x g, 4° C) para extraer las partículas sólidas, conservar el sobrenadante y desechar el precipitado. Almacenar a-20 ° C o -60 ° C para evitar la degradación de autoproteolytic.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Walker, A. A., Weirauch, C., Fry, B. G., King, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venoms+of+heteropteran+insects:+A+treasure+trove+of+diverse+pharmacological+toolkits.">Venoms of heteropteran insects: A treasure trove of diverse pharmacological toolkits.</a> Toxins. 8 (2), 43 (2016).</li><li>Ribeiro, J. M. C., Assump&#231;&#227;o, T. C., Francischetti, I. M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+insight+into+the+sialomes+of+bloodsucking+Heteroptera.">An insight into the sialomes of bloodsucking Heteroptera.</a> Psyche (Stuttg). 2012, 1-16 (2012).</li><li>Ambrose, D. P., Maran, S. P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+protein+content+and+paralytic+potential+of+saliva+of+fed+and+prey+deprived+reduviid+Acanthaspis+pedestris+St&#229;l+(Heteroptera:+Reduviidae:+Reduviinae).">Quantification protein content and paralytic potential of saliva of fed and prey deprived reduviid Acanthaspis pedestris St&#229;l (Heteroptera: Reduviidae: Reduviinae).</a> Indian Journal of Environmental Science. 3 (1), 11-16 (1999).</li><li>Edwards, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+and+compostion+of+the+saliva+of+an+assassin+bug+Platymeris+rhadamanthus+Gaerst.+(Hemiptera,+Reduviidae).">The action and compostion of the saliva of an assassin bug Platymeris rhadamanthus Gaerst. (Hemiptera, Reduviidae).</a> Journal of Experimental Biology. 38, 61-77 (1961).</li><li>Zerachia, T., Bergmann, F., Shulov, A., Kaiser, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Animal and Plant Toxins. , 143-146 (1973).</li><li>Walker, A. A., Hern&#225;ndez-Vargas, M. J., Corzo, G., Fry, B. G., King, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+fish-killing+water+bug+reveals+ancient+and+dynamic+venom+evolution+in+Heteroptera.">Giant fish-killing water bug reveals ancient and dynamic venom evolution in Heteroptera.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. , (2018).</li><li>Walker, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+fish-killing+water+bug+reveals+ancient+and+dynamic+venom+evolution+in+Heteroptera.">Giant fish-killing water bug reveals ancient and dynamic venom evolution in Heteroptera.</a> Cell. Mol. Life Sci. , (2018).</li><li>Walker, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+assassin+bug+Pristhesancus+plagipennis+produces+two+distinct+venoms+in+separate+gland+lumens.">The assassin bug Pristhesancus plagipennis produces two distinct venoms in separate gland lumens.</a> Nature Communications. 9 (1), 755 (2018).</li><li>Hern&#225;ndez-Vargas, M. J., Santib&#225;&#241;ez-L&#243;pez, C. E., Corzo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+insight+into+the+triabin+protein+family+of+American+hematophagous+reduviids:+Functional,+structural+and+phylogenetic+analysis.">An insight into the triabin protein family of American hematophagous reduviids: Functional, structural and phylogenetic analysis.</a> Toxins. 8 (2), 44 (2016).</li><li>Dan, A., Pereira, M. H., Pesquero, J. L., Diotaiuti, L., Beirao, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+of+the+saliva+of+Triatoma+infestans+(Heteroptera:+Reduviidae)+on+sodium+channels.">Action of the saliva of Triatoma infestans (Heteroptera: Reduviidae) on sodium channels.</a> Journal of Medical Entomology. 36 (6), 875-879 (1999).</li><li>Corzo, G., Adachi-Akahane, S., Nagao, T., Kusui, Y., Nakajima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+peptides+from+assassin+bugs+(Hemiptera:+Reduviidae):+isolation,+chemical+and+biological+characterization.">Novel peptides from assassin bugs (Hemiptera: Reduviidae): isolation, chemical and biological characterization.</a> FEBS Letters. 499 (3), 256-261 (2001).</li><li>Sahayaraj, K., Kumar, S. M., Anandh, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+milking+and+electric+shocks+for+venom+collection+from+hunter+reduviids.">Evaluation of milking and electric shocks for venom collection from hunter reduviids.</a> Entomon. 31 (1), 65-68 (2006).</li><li>Silva-Cardoso, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paralytic+activity+of+lysophosphatidylcholine+from+saliva+of+the+waterbug+Belostoma+anurum.">Paralytic activity of lysophosphatidylcholine from saliva of the waterbug Belostoma anurum.</a> Journal of Experimental Biology. 213 (19), 3305-3310 (2010).</li><li>Noeske-Jungblut, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triabin,+a+highly+potent+exosite+inhibitor+of+Thrombin.">Triabin, a highly potent exosite inhibitor of Thrombin.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (48), 28629-28634 (1995).</li><li>Noeske-Jungblut, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inhibitor+of+collagen-induced+platelet+aggregation+from+the+saliva+of+Triatoma+pallidipennis.">An inhibitor of collagen-induced platelet aggregation from the saliva of Triatoma pallidipennis.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 5050-5053 (1994).</li><li>Sahayaraj, K., Borgio, J. F., Muthukumar, S., Anandh, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibacterial+activity+of+Rhynocoris+marginatus+(Fab.)+and+Catamirus+brevipennis+(Servile)+(Hemiptera:+Reduviidae)+venoms+against+human+pathogens.">Antibacterial activity of Rhynocoris marginatus (Fab.) and Catamirus brevipennis (Servile) (Hemiptera: Reduviidae) venoms against human pathogens.</a> Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. 12 (3), 487-496 (2006).</li><li>Haridass, E. T., Ananthakrishnan, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+morphology+of+the+salivary+system+in+some+reduviids+(Insecta-Heteroptera-Reduviidae).">Functional morphology of the salivary system in some reduviids (Insecta-Heteroptera-Reduviidae).</a> Proceedings of the Indian Academy of Sciences. Animal Sciences. 90 (2), 145-160 (1981).</li><li>Maran, S. P. M., Ambrose, D. P., Ignacimuth, A., Sen, A., Janarthanan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biotechnological Applications for Integrated Pest Management. , 125-131 (2000).</li><li>Maran, S. P. M., Selvamuthu, K., Rajan, K., Kiruba, D. A., Ambrose, D. P., Ambrose, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Insect Pest Management, A Current Scenario. , 346-361 (2011).</li><li>Pereira, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anticoagulant+activity+of+Triatoma+infestans+and+Panstrongylus+megistus+saliva+(Hemiptera/Triatominae).">Anticoagulant activity of Triatoma infestans and Panstrongylus megistus saliva (Hemiptera/Triatominae).</a> Acta Tropica. 61, 255-261 (1996).</li><li>Ribeiro, J. M., Marinotti, O., Gonzales, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+salivary+vasodilator+in+the+blood-sucking+bug,+Rhodnius+prolixus.">A salivary vasodilator in the blood-sucking bug, Rhodnius prolixus.</a> British Journal of Pharmacology. 101 (4), 932-936 (1990).</li><li>Ribeiro, J. M., Schneider, M., Guimar&#227;es, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+prolixin-S+(nitrophorin+2),+the+salivary+anticoagulant+of+the+blood-sucking+bug+Rhodnius+prolixus.">Purification and characterization of prolixin-S (nitrophorin 2), the salivary anticoagulant of the blood-sucking bug Rhodnius prolixus.</a> Biochem Journal. 308 (1), 243-249 (1995).</li><li>Swart, C. C., Deaton, L. E., Felgenhauer, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+salivary+gland+and+salivary+enzymes+of+the+giant+waterbugs+(Heteroptera;+Belostomatidae).">The salivary gland and salivary enzymes of the giant waterbugs (Heteroptera; Belostomatidae).</a> Comparative Biochemistry and Physiology A Molecular &amp; Integrative Physiology. 145 (1), 114-122 (2006).</li><li>Rasmussen, S., Young, B., Krimm, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+'spitting'+behaviour+in+cobras+(Serpentes:+Elapidae).">On the 'spitting' behaviour in cobras (Serpentes: Elapidae).</a> Journal of Zoology. 237 (1), 27-35 (1995).</li><li>Fink, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venom+spitting+by+the+green+lynx+spider,+Peucetia+viridans+(Araneae,+Oxyopidae).">Venom spitting by the green lynx spider, Peucetia viridans (Araneae, Oxyopidae).</a> Journal of Arachnology. 12, 372-373 (1984).</li><li>Herzig, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogenesis,+gender,+molting+influence+the+venom+yield+in+the+spider+Coremiocnemis+tropix+(Araneae,+Theraphosidae).">Ontogenesis, gender, molting influence the venom yield in the spider Coremiocnemis tropix (Araneae, Theraphosidae).</a> Journal of Venomous Research. 1, 76-83 (2010).</li><li>Sahayaraj, K., Subramanium, M., Rivers, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+electrophoretic+analyses+of+saliva+from+the+predatory+reduviid+species+Rhynocoris+marginatus+(Fab).">Biochemical and electrophoretic analyses of saliva from the predatory reduviid species Rhynocoris marginatus (Fab).</a> Acta Biochimica Polonica. 60 (1), 91-97 (2013).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El paso más crítico en la recolección de veneno de insecto asesino es seleccionar el método apropiado dependiendo de los propósitos del estudio. Cada uno de los tres métodos presentados para la recolección de heteropteran venenos tiene ventajas y desventajas dependiendo de aplicaciones posteriores.
Inducir a errores a expulsar el veneno de la probóscide (protocolos 1-3) evita la contaminación de veneno por los tejidos glandulares. Además, estos métodos son no letales y pueden repeti...

Heteropteran venenos son sustancias potencialmente bioactivas1. Por ejemplo, las secreciones de saliva/veneno de Heteroptera alimentan de sangre como vinchucas (Triatominae) y chinches de cama (Cimicidae) facilita la alimentación alteran la hemostasia2. Las toxinas de estos venenos objetivo múltiples vías incluyendo la coagulación, agregación plaquetaria y vasoconstricción, así como el dolor y pican caminos. Venenos de la mayoría de otras especies de heteropteran se adaptan para facilitar la depredación más que alimentan de sangre. Sus venenos causan parálisis, muerte y licuefacción del tejido cuando se inyecta en invertebrados3,4. Cuando se inyecta en los vertebrados, su veneno también puede tener efectos drásticos. Por ejemplo, inyección de veneno de insecto asesino Holotrichius innesi en vertebrados provoca parálisis del músculo, dolor y hemorragia; ratones envenomated por este fallo mueren rápidamente debido a la parálisis respiratoria5.
Estudios transcriptómicos, proteómicos han revelado la composición proteica de algunos venenos heteropteran. Venenos de las especies depredadoras son ricos en proteasas, enzimas y péptidos y proteínas de estructura desconocida y función6,7,8. Veneno de la vinchuca es rica en la familia de proteínas de triabin, cuyos miembros afectan profundamente a la coagulación, agregación plaquetaria y vasoconstricción2,9. Sin embargo, no se sabe que las toxinas subyacen la mayoría bioactividades del veneno. Por ejemplo, veneno de la vinchuca Triatoma infestans se ha divulgado para ser analgésico e inhibir los canales de sodio10, pero los componentes responsables siguen siendo ser aclarado. Asimismo, no se sabe qué componentes del veneno de insecto asesino de causan dolor o parálisis. Un requisito previo para identificar las toxinas responsables bioactividades veneno particular y para la caracterización de la estructura y función de las toxinas del veneno de la novela, es la obtención de veneno.
Veneno ha sido obtenido de heteropterans por electroestimulación5,6,7,8,11,12,13, provocación de defensiva respuestas4,8, mecánicamente exprimiendo el tórax12,14,15,16, disección de las glándulas de veneno8,17 ,18,19,20,21,22y la aplicación de agonistas del receptor muscarínico23. Juzgar las posibles ventajas y desventajas de cualquier método es complicado por la morfología de glándulas heteropteran, que consisten en una glándula principal con dos lúmenes separados, la glándula principal anterior (AMG) y posterior glándula principal (PMG), así como un glándula accesoria asociada (AG). Estos compartimientos diferentes glándulas producen secreciones diferentes de proteínas, que pueden ser especializadas para diferentes funciones biológicas incluyendo la captura de presas, defensa y digestión extra oral8,17. En peiratine y ectrichodiine insectos de asesino, el AMG se ha asociado con la captura de presas y el PMG con digestión extra oral17. Sin embargo, en el harpactorine error plagipennis de Pristhesancus el PMG está especializada para la captura de presas y la digestión mientras que el AMG se presume para secretar veneno defensivo8. El AG se ha descrito como teniendo poca función secretora en insectos asesinos8 o como un sitio principal de almacenamiento de información de proteasa en chinches de agua gigantes23. Claramente, más trabajo es necesario aclarar la función de cada compartimiento de la glándula entre distintos subgrupos de heteropteran y para determinar la función de más toxinas del veneno. En este informe se describen los protocolos para la recolección de las toxinas del veneno de heteropterans hacia esta meta.

<table><tbody><tr><td>Electostimulator</td><td>Grass Technologies</td><td>S48 Square Pulse Stimulator</td><td>Electrostimulator allowing pulsed electrostimulation</td></tr><tr><td>Featherlight tweezers</td><td>Australian Entomological Supplies</td><td>E122B</td><td>For handling live venomous insects</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma</td><td>4693124001</td><td>For preventing autoproteolytic digestion of venom</td></tr><tr><td>Dissection equipment</td><td>Australian Entomological Supplies</td><td>E152Micro</td><td>For fine dissections</td></tr><tr><td>Insect pins</td><td>Australian Entomological Supplies</td><td>E162</td><td>For fine dissections</td></tr></tbody></table>

harvesting venom toxins from assassin bugs and other heteropteran insects

Heteropteran insectos tales como chinches (Reduviidae) de asesino y gigante chinches de agua (Belostomatidae) descienden de un antepasado común de colocar y venenoso, y la mayoría de las heteropterans mantener esta estrategia trófica. Algunos heteropterans han pasaron a alimentarse de sangre vertebrado (como vinchucas, Triatominae; y chinches, Cimicidae) mientras otros han vuelto a alimentarse de las plantas (la mayoría Pentatomomorpha). Sin embargo, a excepción de saliva utilizado por vinchucas para facilitar la alimentación de sangre, poco se sabe sobre venenos heteropteran comparados con los venenos de arañas, escorpiones y serpientes.
Uno de los obstáculos a la caracterización de las toxinas del veneno de la heteropteran es la estructura y función de las glándulas de veneno labial, que son morfológicamente complejos y realizar múltiples funciones biológicas (defensa, captura de presas y digestión extra oral). En este artículo, se describen tres métodos que hemos utilizado con éxito para recoger heteropteran venenos. En primer lugar, presentamos la electroestimulación como una manera conveniente de recoger veneno que suele ser letal cuando se inyecta en animales de presa, y que evita la contaminación por el tejido glandular. En segundo lugar, mostramos que el acoso suave de animales es suficiente para producir extrusión de veneno de la probóscide o veneno escupe en algunos grupos de heteropterans. En tercer lugar, se describen métodos para sacar las toxinas del veneno por la disección de animales anestesiados para obtener de las glándulas de veneno. Este método es complementario a otros métodos, como pueden permitir extracción de toxinas de taxa en los que la electroestimulación y el acoso son ineficaces. Estos protocolos permiten a los investigadores recoger toxinas de insectos heteropteran para la caracterización de la estructura y función y posibles aplicaciones en medicina y agricultura.

Algunas especies heteropteran como la harpactorine p. plagipennis y el reduviine Platymeris Radamanto, fiable rendimiento grandes cantidades (5-20 μl) de venom en respuesta a la electroestimulación (tabla 1). En general, más peiratine, reduviine y harpactorine bugs rendimiento veneno en respuesta a este método. Entre stenopodaine bugs, electroestimulación produce veneno de Oncocephalus SP., pero no Thodelmus sp. Los errores holopti...

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Harvesting Venom Toxins from Assassin Bugs and Other Heteropteran Insects

Aunque muchos insectos en el suborden Heteroptera (Insecta: Hemiptera) son venenoso, su composición del veneno y las funciones de las toxinas de su veneno son en su mayoría desconocidas. Este protocolo describe métodos para cosechar heteropteran venenos de más caracterización, mediante electroestimulación, acoso y disección de la glándula.

Recolección de las toxinas del veneno de insectos asesinos y otros insectos Heteropteran

Heteropteran insects such as assassin bugs (Reduviidae) and giant water bugs (Belostomatidae) descended from a common predaceous and venomous ancestor, ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Environment

13.0K vistas.  The University of Queensland. Aunque muchos insectos en el suborden Heteroptera (Insecta: Hemiptera) son venenoso, su composición del veneno y las funciones de las toxinas de su veneno son en su mayoría desconocidas. Este protocolo describe métodos para cosechar heteropteran venenos de más caracterización, mediante electroestimulación, acoso y disección de la glándula.

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Helminth Collection and Identification from Wildlife

Wild animals are commonly parasitized by a wide range of helminths. The four major types of helminths are &#34;roundworms&#34; (nematodes), &#34;thorny-headed worms&#34; (acanthocephalans), &#34;flukes&#34; (trematodes), and &#34;tapeworms&#34; (cestodes). The optimum method for collecting helminths is to examine a host that has been dead less than 4-6 hr since most helminths will still be alive. A thorough necropsy should be conducted and all major organs examined. Organs are washed over a 106 &#956;m sieve under running water and contents examined under a stereo microscope. All helminths are counted and a representative number are fixed (either in 70% ethanol, 10% buffered formalin, or alcohol-formalin-acetic acid). For species identification, helminths are either cleared in lactophenol (nematodes and small acanthocephalans) or stained (trematodes, cestodes, and large acanthocephalans) using Harris&#39; hematoxylin or Semichon&#39;s carmine. Helminths are keyed to species by examining different structures (e.g. male spicules in nematodes or the rostellum in cestodes). The protocols outlined here can be applied to any vertebrate animal. They require some expertise on recognizing the different organs and being able to differentiate helminths from other tissue debris or gut contents. Collection, preservation, and staining are straightforward techniques that require minimal equipment and reagents. Taxonomic identification, especially to species, can be very time consuming and might require the submission of specimens to an expert or DNA analysis.

Wild animals are commonly parasitized by a wide range of helminths.&#160; The four major types of helminths are &#8220;roundworms&#8221; (nematodes), &#8220;thorny-headed worms&#8221; (acanthocephalans), &#8220;flukes&#8221; (trematodes), and &#8220;tapeworms&#8221; (cestodes).&#160; Here we describe how helminths are collected from a vertebrate animal and how they are preserved and taxonomically identified.&#160;

Wild animals are commonly parasitized by a wide range of helminths. The four major types of helminths are &#34;roundworms&#34; (nematodes), ...

Investigación

Medio ambiente

Quantification of Heavy Metals and Other Inorganic Contaminants on the Productivity of Microalgae

Increasing demand for renewable fuels has researchers investigating the feasibility of alternative feedstocks, such as microalgae. Inherent advantages include high potential yield, use of non-arable land and integration with waste streams. The nutrient requirements of a large-scale microalgae production system will require the coupling of cultivation systems with industrial waste resources, such as carbon dioxide from flue gas and nutrients from wastewater. Inorganic contaminants present in these wastes can potentially lead to bioaccumulation in microalgal biomass negatively impact productivity and limiting end use. This study focuses on the experimental evaluation of the impact and the fate of 14 inorganic contaminants (As, Cd, Co, Cr, Cu, Hg, Mn, Ni, Pb, Sb, Se, Sn, V and Zn) on Nannochloropsis salina growth. Microalgae were cultivated in photobioreactors illuminated at 984 &#181;mol m-2 sec-1 and maintained at pH 7 in a growth media polluted with inorganic contaminants at levels expected based on the composition found in commercial coal flue gas systems. Contaminants present in the biomass and the medium at the end of a 7 day growth period were analytically quantified through cold vapor atomic absorption spectrometry for Hg and through inductively coupled plasma mass spectrometry for As, Cd, Co, Cr, Cu, Mn, Ni, Pb, Sb, Se, Sn, V and Zn. Results show N. salina is a sensitive strain to the multi-metal environment with a statistical decrease in biomass yieldwith the introduction of these contaminants. The techniques presented here are adequate for quantifying algal growth and determining the fate of inorganic contaminants.

Integration of microalgal cultivation with industrial flue gas will ultimately introduce heavy metals and other inorganic compounds into the growth media. This study presents a procedure used to determine the end fate and impact of heavy metals and inorganic contaminants on the growth of Nannochloropsis salina grown in photobioreactors.

La cuantificación de los metales pesados ​​y otros contaminantes inorgánicos en la productividad de microalgas

Increasing demand for renewable fuels has researchers investigating the feasibility of alternative feedstocks, such as microalgae. Inherent advantages ...

Assaying Predatory Feeding Behaviors in Pristionchus and Other Nematodes

This protocol provides multiple methods for the analysis and quantification of predatory feeding behaviors in nematodes. Many nematode species including Pristionchus pacificus display complex behaviors, the most striking of which is the predation of other nematode larvae. However, as these behaviors are absent in the model organism Caenorhabditis elegans, they have thus far only recently been described in detail along with the development of reliable behavioral assays 1. These predatory behaviors are dependent upon phenotypically plastic but fixed mouth morphs making the correct identification and categorization of these animals essential. In P. pacificus there are two mouth types, the stenostomatous and eurystomatous morphs 2, with only the wide mouthed eurystomatous containing an extra tooth and being capable of killing other nematode larvae. Through the isolation of an abundance of size matched prey larvae and subsequent exposure to predatory nematodes, assays including both "corpse assays" and "bite assays" on correctly identified mouth morph nematodes are possible. These assays provide a means to rapidly quantify predation success rates and provide a detailed behavioral analysis of individual nematodes engaged in predatory feeding activities. In addition, with the use of a high-speed camera, visualization of changes in pharyngeal activity including tooth and pumping dynamics are also possible.

Assaying Predatory Feeding Behaviors in Pristionchus and Other Nematodes

Behavioral assays provide powerful tools for understanding neuronal function. Here we present several protocols for quantifying predatory feeding behavior found in the model nematode Pristionchus pacificus and its relatives. Additionally, we provide methods for analyzing predatory feeding adaptations including mouth structures and teeth.

El ensayo de los comportamientos de alimentación depredadores en<em&gt; Pristionchus</em&gt; Y otros nematodos

This protocol provides multiple methods for the analysis and quantification of predatory feeding behaviors in nematodes. Many nematode species including ...

Extraction of Organochlorine Pesticides from Plastic Pellets and Plastic Type Analysis

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment during manufacturing and transport. Because of their environmental persistence, they are widely distributed in the oceans and on beaches all over the world. They can act as a vector of potentially toxic organic compounds (e.g., polychlorinated biphenyls) and might consequently negatively affect marine organisms. Their possible impacts along the food chain are not yet well understood. In order to assess the hazards associated with the occurrence of plastic pellets in the marine environment, it is necessary to develop methodologies that allow for rapid determination of associated organic contaminant levels. The present protocol describes the different steps required for sampling resin pellets, analyzing adsorbed organochlorine pesticides (OCPs) and identifying the plastic type. The focus is on the extraction of OCPs from plastic pellets by means of a pressurized fluid extractor (PFE) and on the polymer chemical analysis applying Fourier Transform-InfraRed (FT-IR) spectroscopy. The developed methodology focuses on 11 OCPs and related compounds, including dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT) and its two main metabolites, lindane and two production isomers, as well as the two biologically active isomers of technical endosulfan. This protocol constitutes a simple and rapid alternative to existing methodology for evaluating the concentration of organic contaminants adsorbed on plastic pieces.

Microplastics act as vector of potentially toxic organic contaminants with unpredictable effects. This protocol describes an alternative methodology for assessing the levels of organochlorine pesticides adsorbed on plastic pellets and identifying the polymer chemical structure. The focus is on pressurized fluid extraction and attenuated total reflectance Fourier transform infrared spectroscopy.

Extracción de plaguicidas organoclorados de pellets de plástico y análisis de tipos de plástico

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment ...

Extraction and Characterization of Surfactants from Atmospheric Aerosols

Surface-active compounds, or surfactants, present in atmospheric aerosols are expected to play important roles in the formation of liquid water clouds in the Earth&#39;s atmosphere, a central process in meteorology, hydrology, and for the climate system. But because specific extraction and characterization of these compounds have been lacking for decades, very little is known on their identity, properties, mode of action and origins, thus preventing the full understanding of cloud formation and its potential links with the Earth&#39;s ecosystems.
In this paper we present recently developed methods for 1) the targeted extraction of all the surfactants from atmospheric aerosol samples and for the determination of 2) their absolute concentrations in the aerosol phase and 3) their static surface tension curves in water, including their Critical Micelle Concentration (CMC). These methods have been validated with 9 references surfactants, including anionic, cationic and non-ionic ones. Examples of results are presented for surfactants found in fine aerosol particles (diameter &#60;1 &#956;m) collected at a coastal site in Croatia and suggestions for future improvements and other characterizations than those presented are discussed.

Methods are presented for the targeted extraction of surfactants present in atmospheric aerosols and the determination of their absolute concentrations and surface tension curves in water, including their Critical Micelle Concentration (CMC).

Extracción y caracterización de los agentes tensioactivos de los aerosoles atmosféricos

Surface-active compounds, or surfactants, present in atmospheric aerosols are expected to play important roles in the formation of liquid water clouds in ...

Parasitación artificial del huésped por Trichogramma dendrolimi y extracción de veneno

Extracting Venom from the Parasitoid Wasp Trichogramma dendrolimi Using an Artificial Host

Parasitoid wasps are a diverse group of hymenopteran insects that serve as invaluable resources for pest biocontrol. To ensure successful parasitism, parasitoid wasps inject venom into their hosts to suppress their hosts&#39; immunity, modulate hosts&#39; development, metabolism, and even behavior. With over 600,000 estimated species, the diversity of parasitoid wasps surpasses that of other venomous animals, such as snakes, cone snails, and spiders. Parasitoid wasp venom is an underexplored source of bioactive molecules with potential applications in pest control and medicine. However, collecting parasitoid venom is challenging due to the inability to use direct or electrical stimulation and the difficulty in dissection because of their small size. Trichogramma is a genus of tiny (~0.5 mm) egg parasitoid wasps that are widely used for the biological control of lepidopteran pests in both agriculture and forests. Here, we report a method for extracting venom from T. dendrolimi using artificial hosts. These artificial hosts are created with polyethylene film and amino acid solutions and then inoculated with Trichogramma wasps for parasitism. The venom was subsequently collected and concentrated. This method enables the extraction of large amounts of Trichogramma venom while avoiding contamination from other tissues caused by dissection, a common issue in venom reservoir dissection protocols. This innovative approach facilitates the study of Trichogramma venom, paving the way for new research and potential applications.

Autor destacado: Método eficiente de extracción de veneno de avispas parasitoides Trichogramma 

Here, we present a protocol for extracting venom from Trichogramma dendrolimi using an artificial host created with polyethylene film and amino acid solution.

Extracción de veneno de la avispa parasitoide Trichogramma dendrolimi utilizando un huésped artificial

Parasitoid wasps are a diverse group of hymenopteran insects that serve as invaluable resources for pest biocontrol. To ensure successful parasitism, ...

Bioquímica

Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands

Modern spiders spin high-performance silk fibers with a broad range of biological functions, including locomotion, prey capture and protection of developing offspring 1,2. Spiders accomplish these tasks by spinning several distinct fiber types that have diverse mechanical properties. Such specialization of fiber types has occurred through the evolution of different silk-producing glands, which function as small biofactories. These biofactories manufacture and store large quantities of silk proteins for fiber production. Through a complex series of biochemical events, these silk proteins are converted from a liquid into a solid material upon extrusion.
Mechanical studies have demonstrated that spider silks are stronger than high-tensile steel 3. Analyses to understand the relationship between the structure and function of spider silk threads have revealed that spider silk consists largely of proteins, or fibroins, that have block repeats within their protein sequences 4. Common molecular signatures that contribute to the incredible tensile strength and extensibility of spider silks are being unraveled through the analyses of translated silk cDNAs. Given the extraordinary material properties of spider silks, research labs across the globe are racing to understand and mimic the spinning process to produce synthetic silk fibers for commercial, military and industrial applications. One of the main challenges to spinning artificial spider silk in the research lab involves a complete understanding of the biochemical processes that occur during extrusion of the fibers from the silk-producing glands.
Here we present a method for the isolation of the seven different silk-producing glands from the cobweaving black widow spider, which includes the major and minor ampullate glands [manufactures dragline and scaffolding silk] 5,6, tubuliform [synthesizes egg case silk] 7,8, flagelliform [unknown function in cob-weavers], aggregate [makes glue silk], aciniform [synthesizes prey wrapping and egg case threads] 9 and pyriform [produces attachment disc silk] 10. This approach is based upon anesthetizing the spider with carbon dioxide gas, subsequent separation of the cephalothorax from the abdomen, and microdissection of the abdomen to obtain the silk-producing glands. Following the separation of the different silk-producing glands, these tissues can be used to retrieve different macromolecules for distinct biochemical analyses, including quantitative real-time PCR, northern- and western blotting, mass spectrometry (MS or MS/MS) analyses to identify new silk protein sequences, search for proteins that participate in the silk assembly pathway, or use the intact tissue for cell culture or histological experiments.

Here we describe an efficient strategy to remove the silk-producing glands from the abdomen of female black widow spiders. This procedure allows the rapid isolation of the seven distinct silk-producing glands in a highly purified fashion, an important process for investigators studying spider silk production and fiber assembly.

Microdisección de Negro Araña Viuda producción de las glándulas de seda

Modern spiders spin high-performance silk fibers with a broad range of biological functions, including locomotion, prey capture and protection of ...

Biología

Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional characterization of venom proteins has important biomedical applications, including the identification of drug leads or probes for cellular receptors. Spiders are the most species rich clade of venomous organisms, but the venoms of only a few species are well-understood, in part due to the difficulty associated with collecting minute quantities of venom from small animals. This paper presents a protocol for the collection of venom from spiders using electrical stimulation, demonstrating the procedure on the Western black widow (Latrodectus hesperus). The collected venom is useful for varied downstream analyses including direct protein identification via mass spectrometry, functional assays, and stimulation of venom gene expression for transcriptomic studies. This technique has the advantage over protocols that isolate venom from whole gland homogenates, which do not separate genuine venom components from cellular proteins that are not secreted as part of the venom. Representative results demonstrate the detection of known venom peptides from the collected sample using mass spectrometry. The venom collection procedure is followed by a protocol for dissecting spider venom glands, with results demonstrating that this leads to the characterization of venom-expressed proteins and peptides at the sequence level.

This article provides a protocol for the extraction of venom from spiders using electrical stimulation in order to 1) conduct proteomic characterization, 2) stimulate venom gland gene expression, and 3) perform functional studies of venoms. This is followed by a description of venom gland microdissections for gene expression studies.

Recolección de las toxinas del veneno de insectos asesinos y otros insectos Heteropteran

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Helminth Collection and Identification from Wildlife

La cuantificación de los metales pesados y otros contaminantes inorgánicos en la productividad de microalgas

El ensayo de los comportamientos de alimentación depredadores en

Extracción de plaguicidas organoclorados de pellets de plástico y análisis de tipos de plástico

Extracción y caracterización de los agentes tensioactivos de los aerosoles atmosféricos

Extracción de veneno de la avispa parasitoide Trichogramma dendrolimi utilizando un huésped artificial

Extracción de veneno de la avispa parasitoide Trichogramma dendrolimi utilizando un huésped artificial

Extracción de veneno de la avispa parasitoide Trichogramma dendrolimi utilizando un huésped artificial

Microdisección de Negro Araña Viuda producción de las glándulas de seda

La extracción del veneno y veneno glándula microdisecciones de arañas de Proteómica y análisis Transcriptomic

Recolección de las toxinas del veneno de insectos asesinos y otros insectos Heteropteran

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Helminth Collection and Identification from Wildlife

La cuantificación de los metales pesados ​​y otros contaminantes inorgánicos en la productividad de microalgas

El ensayo de los comportamientos de alimentación depredadores en

Extracción de plaguicidas organoclorados de pellets de plástico y análisis de tipos de plástico

Extracción y caracterización de los agentes tensioactivos de los aerosoles atmosféricos

Extracción de veneno de la avispa parasitoide Trichogramma dendrolimi utilizando un huésped artificial

Extracción de veneno de la avispa parasitoide Trichogramma dendrolimi utilizando un huésped artificial

Extracción de veneno de la avispa parasitoide Trichogramma dendrolimi utilizando un huésped artificial

Microdisección de Negro Araña Viuda producción de las glándulas de seda

La extracción del veneno y veneno glándula microdisecciones de arañas de Proteómica y análisis Transcriptomic

La cuantificación de los metales pesados y otros contaminantes inorgánicos en la productividad de microalgas