Name: analysis of lymphocyte extravasation using an in vitro model of the human blood-brain barrier
Uploaded: 2017-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
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This study has been supported by the Collaborative Research Centre CRC TR128 "Initiating/Effector versus Regulatory Mechanisms in Multiple Sclerosis-Progress towards Tackling the Disease" (Project A9 to H.W. and C.C.G., project B1 to N.S.).

1. Cultivo celular de cerebro humano Las células endoteliales microvasculares (HBMEC) <ol><li> Recubrimiento de matraces de cultivo celular <ol><li> Para preparar la solución de fibronectina, añadir 10 ml de PBS a un tubo de centrífuga de 15 ml. Añadir 150! L fibronectina y mezclar bien. </li><li> Para cubrir la parte inferior de un frasco de cultivo de células T-25 Añadir 2 ml de la solución de fibronectina. Incubar el matraz de cultivo de células durante al menos 3 h a 37 ° C en la incubadora. Matraces recubiertos de fibronectina se pueden almacenar durante 2 semanas a 37 ° C / 5% de CO2. </li></ol></li><li> La siembra y cultivo de células de HBMEC <ol><li> solución de fibronectina Aspirar desde el fondo del matraz de cultivo celular. Añadir 7,2 x 10 4 HBMEC / cm² en suspensión en 6 ml ECM-b medio (= ECM-b suplementado con 5% de suero bovino fetal, 1% de penicilina / estreptomicina y 1% de suplemento de crecimiento endotelial celular). Incubar a 37 ° C / 5% de CO2. Compruebe el crecimiento celular diariamente utilizando un microscopio. </li><li> Cambiar el medio cada 3 días.Recoger o de células de división, cuando HBMEC alcanzan aproximadamente 80% de confluencia. HBMEC se debe utilizar entre el paso 1 y 15 para evitar la pérdida de propiedades fisiológicas. </li></ol></li><li> Cosecha HBMEC. <ol><li> Preparar Accutase solución mezclando Accutase (1x) con PBS en una proporción de 1: 1. Mantenga Accutase solución a 37 ° C en un baño de agua hasta su uso posterior. </li><li> Transferencia ECM-b medio del matraz de cultivo celular a un tubo de centrífuga de 15 ml. Lavar HBMEC mediante la adición de 5 ml de PBS a la parte inferior del frasco de cultivo celular. Aspirar PBS y repetir la etapa de lavado dos veces más. </li><li> Añadir 2 ml de solución pre-calentado Accutase. Incubar a 37 ° C durante 2 min. Después, HBMEC se resuspenden tocando firmemente el matraz de cultivo de células varias veces. desprendimiento de células se controla mediante un microscopio </li><li> El ECM-b-medio almacenado previamente en un tubo de 15 ml se añadió de nuevo al matraz de cultivo celular tan pronto como se inicia HBMEC a separar. Enjuague el fondo del matraz varias veces hasta que la mayoría son HBMECre-suspendido. </li><li> Transferir la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 15 ml. Centrifugar a 300 xg durante 10 min a temperatura ambiente. Desechar el sobrenadante y las células en 1 ml ECM-b medio resuspender. Recuento de células y diluir la suspensión de células para alcanzar una concentración final de 3 x 10 5 HBMEC por ml ECM-b medio. </li></ol></li></ol> 2. Preparación de la Célula de Cultura Inserts <ol><li> Recubrimiento de insertos de cultivo celular Nota importante: Evitar tocar la membrana de los insertos de cultivo celular. <ol><li> Añadir 100! L solución de fibronectina (véase 1.1.1) para cada inserto de cultivo celular (Figura 1A) y un pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo plano (control óptico también). Incubar durante al menos 3 h a 37 ° C. Después de solución de incubación aspirado de fibronectina. </li><li> Añadir 100 ml HBMEC suspensión a los insertos de cultivo celular y el control óptico también. Añadir 600 l ECM-b medio para el compartimiento inferior de la célulainsertos de cultivo. Incubar durante 3 - 4 días a 37 ° C / 5% de CO 2 hasta integridad de la barrera (Figura 1B) se alcanza, comprobar el crecimiento celular por evaluación microscópica de la HBMEC en el control óptico también. Nota: No se recomienda el crecimiento celular más allá de cuatro días. </li><li> Opcional: Para imitar las condiciones inflamatorias Aspirar el medio desde el compartimiento inferior y reemplazarlo con ECM-b medio suplementado con 500 U / ml de IFN-γ / TNF-α 24 h antes el ensayo de migración. </li></ol></li></ol> 3. Control de Calidad con azul de Evans en el Día del ensayo de transmigración <ol><li> Preparación de solución de azul de Evans <ol><li> Para preparar PBS / B27 mezcla de solución 10 ml de PBS con 200 l suplemento B27 usando un tubo de centrífuga de 15 ml. Diluir la solución madre de azul de Evans (20 mg / ml PBS) 1: 1000 con PBS / B27. </li></ol></li><li> ensayo de permeabilidad azul de Evans <ol><li> Aspirar el medio desde el compartimiento inferior seguido por el compartimiento superiorde un inserto de cultivo celular que contiene un confluente HBMEC monocapa. Añadir 100! L de solución de azul de Evans al inserto de cultivo celular. </li><li> Añadir 600! L de PBS / B27 para el compartimiento inferior y se incuba durante 60 min a 37 ° C / 5% de CO2. Retire cuidadosamente la inserción de cultivo celular utilizando fórceps. </li></ol></li><li> medición de azul de Evans <ol><li> Retirar PBS / B27 desde el compartimiento inferior y transferir 100! L cada uno a dos pocillos de una poliestirol negro placa de 96 pocillos de fondo plano. Inserte la placa en un lector de placa Tecan Pro Infinito M200 y determinar z-posición óptima. </li><li> Medida de excitación de azul usando ajustes respectivos Evans (por ejemplo: excitación: 620 nm, emisión: 680 nm, ancho de banda de excitación: 9 nm, ancho de banda de emisión: 20 nm, la mejora 175x, 25 parpadea, el tiempo de integración: 20 mu s). </li><li> Para determinar las funciones de barrera HBMEC comparar datos adquiridos con una curva patrón que representa evans permeación azul a través HBMEC en diferentes puntos de tiempo después de semillacélulas ING (Figura 1B, derecha). </li></ol></li></ol> 4. Ensayo de migración <ol><li> Preparación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). <ol><li> Añadir 10 ml de RPMI en un tubo de centrífuga de 15 ml y añadir 200 l suplemento B27. Recuento de células PBMC y centrifugar a 300 xg durante 5 min. Vuelva a suspender PBMC a una concentración final de 5 x 10 6 células / ml RPMI / B27. </li></ol></li><li> Puesta en marcha del ensayo de migración <ol><li> Medio Aspirar desde el compartimiento inferior seguido por el compartimiento superior de los insertos de cultivo de células que contienen confluente HBMEC monocapas (Figura 1A). Por donante añadir 100 l PBMC suspensión cada uno para los insertos de cultivo celular y también a un pocillo de una placa de 24 pocillos por (control in vitro). </li><li> Añadir 600! L RPMI / B27 para el compartimiento inferior de los insertos de cultivo celular y 500 l a la PBMC del control in vitro y se incuba 6 horas a 37 ° C / 5% de CO2. </li&gt; </ol></li><li> La recolección de migrada PBMC <ol><li> Extraer el inserto de cultivo celular utilizando fórceps y enjuagar cuidadosamente la parte inferior con 400 l de PBS sin tocar la membrana. Desechar el inserto de cultivo celular. </li><li> Añadir 20 l fluoroesferas de recuento de flujo (aproximadamente 1.000 cuentas / ml) al compartimento inferior del cultivo celular insertan así como para el control in vitro y se mezclan bien. Transferir 1 ml de resultante suspensión de PBMC a la citometría de flujo tubos. </li></ol></li></ol> 5. Citometría de Flujo <ol><li> preparación de la muestra <ol><li> Centrifugar PBMC a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Preparar la solución de anticuerpo mediante la adición de anticuerpos conjugados con fluorocromo a 100! L de tampón citometría de flujo (/ EDTA mM PBS / 1% BSA 2) por muestra. Para los resultados presentados a continuación 1 l CD4-FITC, 1 μLCD3-PerCP / Cy5.5, 1 l CD56-PC7, 1 l CD8-A700, y 1 l CD16-A750 se utilizaron por muestra. </li><li> Resuspender PBMC en 100 l de la solución de anticuerpo y se incuba durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Añadir 250! L de tampón de citometría de flujo y se centrifuga a 300 xg durante 5 min. </li></ol></li><li> la adquisición de muestras <ol><li> Vuelva a suspender PBMC en la cantidad requerida (varía dependiendo de la citómetro de flujo utilizado) de citometría de flujo de tampón. </li><li> Adquirir manchado PBMC usando un citómetro de flujo con un detector activo entre 525 y 700 nm de longitud de onda para detectar fluoroesferas de recuento de flujo (excitación 488 nm, emisión de 525 - 700 nm). (Los pasos siguientes son un ejemplo si se usa un flujo Gallios citómetro operado con software Kaluza G:. (1) Iniciar el equipo (2) Cuando el sistema operativo se ha cargado completamente, inicie el citómetro de flujo pulsando la tecla &quot;citómetro en&quot; botón . (3) Cargar el protocolo de adquisición respectiva pulsando el botón &quot;protocolo abierto&quot;. (4) seleccione el protocolo requerido y seleccione &quot;abrir&quot;. (5) Duplicar el protocolo para cada muestra haciendo clic con el derechobotón del ratón sobre el protocolo visible en el carrusel virtual y un clic izquierdo en el campo &quot;duplicado&quot;. (6) Etiqueta de cada muestra en la lista de muestras. (7) Transferir las muestras a las posiciones indicadas del carrusel y comenzar la adquisición.) </li></ol></li><li> análisis de las muestras <ol><li> Abrir flujo resultante citometría de datos utilizando el software respectivo. Determinar el número de subpoblaciones de interés para transmigrado PBMC así como las células de los pocillos de control in vitro y fluoroesferas de recuento de flujo usando el software de análisis respectiva. (Un ejemplo de la estrategia de gating se da en la parte resultados (Figura 1 C: Para analizar la transmigración de los subconjuntos de células NK, primero seleccionar linfocitos en un canal de dispersión lateral (SSC) frente hacia adelante canal de dispersión parcela (FSC) Los linfocitos son. a continuación, muestran en una CD3 frente trama CD56 y CD56 + CD3 -. se seleccionan las células NK Para distinguir entre subconjuntos de células NK, las células NK se muestran enuna parcela CD56 frente a CD16 y CD56 CD16 brillante dim / - las células NK, así como CD56 dim CD16 + se seleccionan. Además, fluoroesferas de recuento de flujo se seleccionan de una parcela FSC frente a SSC y, posteriormente, se muestra en una parcela de un canal con una emisión entre 525 y 700 nm frente al tiempo para determinar su número). </li><li> Para calcular el número total de células de cada muestra, normalizar el número detectado de las células usando fluoroesferas de recuento de flujo: <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/55390/55390eq1.jpg" /></li><li> Determinar el porcentaje de células migradas como la relación entre el total de células migradas y las células totales en el control in vitro. </li></ol></li></ol>

The author(s) declared the following potential conflicts of interest with respect to the research, authorship, and/or publication of this article: A.S.-M. and U.B. have no financial disclosures. T. S.-H. received travel and conference expenses from Biogen. N.S. received speaker and advisory board honoraria from Biogen and Novartis Pharma, as well as travel expenses from Biogen. H.W. received compensation for serving on Scientific Advisory Boards/Steering Committees for Bayer Healthcare, Biogen, Merck Serono, Novartis, and Sanofi-Genzyme. He also received speaker honoraria and travel support from Bayer Vital GmbH, Bayer Schering AG, Biogen, CSL Behring, Fresenius Medical Care, Glaxo Smith Kline, GW Pharmaceuticals, Lundbeck, Merck Serono, Omniamed, Novartis, and Sanofi-Genzyme. He received compensation as a consultant from Biogen, Merck Serono, Novartis, and Sanofi-Genzyme. H.W. received research support from Bayer Vital, Biogen, Genzyme, Merck Serono, Novartis, Sanofi-Aventis Germany, and Sanofi US. C.C.G. received speaker honoraria and travel expenses for attending meetings from Genzyme, Novartis Pharma GmbH, and Bayer Health Care.

Aquí presentamos una técnica para investigar la transmigración de los linfocitos a través de la barrera sangre-cerebro humano. El análisis in vitro de la migración de linfocitos al SNC es importante para estudiar los procesos básicos de la extravasación de linfocitos, posibles alteraciones relacionadas con la enfermedad, y los nuevos enfoques terapéuticos. Varias modificaciones del modelo de barrera hematoencefálica son posibles. Por ejemplo, las células del compartimiento superior podrían ser analizados para investigar la composición de la población de células no migradas. Además, el tratamiento de la monocapa HBMEC con IFN-γ y TNF-α 24 horas antes del ensayo se puede utilizar para imitar una barrera sangre-cerebro inflamado con el fin de estudiar el efecto de los trastornos del SNC inflamatorias 21, 25. Del mismo modo, el tratamiento de HBMEC o linfocitos con otras sustancias permite la investigación de sus efectos sobre la extravasación de linfocitos (por ejemplo, suefecto sobre las moléculas de adhesión) 30, 31. La participación de ciertas moléculas de adhesión puede ser estudiada usando anticuerpos bloqueantes para las integrinas o sus ligandos 32. Además, la configuración experimental presentado aquí permite el análisis de los efectos quimiotácticos de las quimiocinas o sobrenadantes derivados de astrocitos u otras células 33, 34. Sustitución de HBMEC con células epiteliales derivadas del cerebro humano primarios amplía el espectro de esta configuración experimental para la investigación de la barrera sangre-líquido cefalorraquídeo 15. HBMEC no debe ser sustituido con células endoteliales inmortalizadas o células derivadas de otros órganos para mantener CNS-especificidad del modelo. Sin embargo, las células endoteliales cerebrales derivados de otras especies pueden ser utilizados para analizar la transmigración en los animales respectivos 35. Además, el ácido retinoico o hidrocortisone se han descrito para aumentar las funciones de barrera y por lo tanto podrían emplearse 36, 37. En el caso de los números de células limitado la cantidad de células sometidas al ensayo podría reducirse, ya que nuestro modelo proporciona tasas de recuperación lineal entre 2 x 10 5 y 1 x 10 6 PBMC (datos no mostrados). Para analizar poblaciones de células raras siguientes transmigración podría ser necesario a las células de la piscina desde varios pozos con el fin de obtener células suficientes requeridas para citometría de flujo. Por último, nuestra configuración experimental también podría ser utilizado para estudiar la administración de fármacos en el SNC 38. Un tamaño de poro de 3 micras se utiliza típicamente para permitir que la transmigración de linfocitos, mientras que un tamaño de poro de 0,4 micras impide la transmigración de linfocitos, pero permite estudiar la administración de fármacos 39, 40, 41, 42. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; A pesar de las diversas aplicaciones de la configuración experimental descrito aquí, varios puntos tienen que ser tenidos en cuenta para asegurar resultados significativos. La integridad de la membrana porosa, así como la monocapa HBMEC es crítica. Por lo tanto, es obligatorio para evitar el daño físico de la membrana, por ejemplo, con puntas de pipeta. La adición de líquidos o suspensión celular a la parte superior de la inserción de cultivo de células se debe realizar sin contacto directo. Gotitas podrían ser borrados en la frontera de la inserción de cultivo celular. la colocación horizontal de la punta de la pipeta asegura la protección de la membrana, cuando la membrana abluminal se enjuaga en el extremo del ensayo de migración. La calidad de la monocapa HBMEC puede analizarse mediante evaluación microscópica de confluencia, así como evans permeación azul como se ha demostrado para la evaluación de integridad de la barrera hematoencefálica en experimentos con roedores 43. La centrifugación de HBMEC a fuerzas g bajos y el uso de los primeros pasajes (es decir, </em&gt; 1 - 15) asegura la calidad y uniformidad de la monocapa. Para evitar la disolución de la membrana porosa, es importante seguir el orden descrito de la aspiración y la adición de medio, cuando se trabaja con la monocapa HBMEC. Aunque la adherencia con el protocolo descrito aquí asegura resultados significativos y reproducibles, esta técnica tiene algunas limitaciones. En primer lugar, in vivo la barrera sangre-cerebro está formado por un número de células, que interactúan de diversas maneras y reforzar la función de barrera al afectar a la formación de uniones estrechas 1. Por lo tanto, aunque este modelo de barrera hematoencefálica es una buena aproximación de la situación in vivo, aspectos importantes faltan. Además, la extravasación de linfocitos en el SNC a través de la barrera sangre-cerebro es un proceso de múltiples pasos. Mientras que cada solo paso puede ser investigado por separado, la técnica que aquí se presenta no proporciona información sobre la que sele proceso de extravasación bajo la influencia de fuerzas de cizallamiento 2, 44, 45, 46. Finalmente, el análisis de células migradas de PBMC puede ser un reto en función de la frecuencia de las células de interés, porque por lo general sólo frecuencias de un solo dígito de células transmigran. Por lo tanto, la separación de las poblaciones de interés antes del ensayo o la agrupación de células migradas a través de múltiples insertos de cultivo celular podría ser necesario. Otros modelos para el análisis de la migración de leucocitos en el SNC cubren algunos de los aspectos que faltan en nuestro modelo. Co-cultivo con astrocitos, pericitos, y / o las neuronas se utilizan para imitar la complejidad de la barrera sangre-cerebro mejor 47. Los modelos que incluyen fuerzas de cizallamiento, tales como DIV-BBB reflejan más las condiciones fisiológicas, por lo tanto, lo que permite un análisis más sofisticado de diapedesis de linfocitos 48. </p&gt; En resumen, presentamos una técnica fácilmente accesible para la investigación de la diapedesis de linfocitos cualitativa y cuantitativa a través de la barrera sangre-cerebro humano.

la migración de linfocitos de la sangre a los tejidos es crucial para la vigilancia inmune. Una secuencia de interacciones moleculares específicas asegura sitio extravasación específico en el intestino delgado, piel, ganglios linfáticos, el sistema nervioso central (SNC), y otros tejidos 1. Las alteraciones en la migración de linfocitos están implicados en la fisiopatología de una serie de enfermedades de amplia difusión 2. Migración en la inmuno-privilegiado CNS está estrechamente regulada y, en consecuencia alteraciones de este proceso están involucrados en las enfermedades relacionadas con el SNC como la encefalomielitis 3, neuromielitis óptica, derrame cerebral y la esclerosis múltiple (MS) 2, 4, 5, 6, 7. Por lo tanto, es importante estudiar la extravasación de linfocitos para entender mejor la fisiopatología de la enfermedad y el desarrollo de herramientas para una<html> mejoramiento del terreno de carga 8, 9, 10, 11, 12 enfermedad. Los linfocitos migran al SNC a través de rutas distintas. La extravasación a través de las vénulas postcapilares en el espacio subaracnoideo a través de la barrera sangre-líquido cefalorraquídeo dentro del plexo coroideo y través de la barrera sangre-cerebro se han descrito 1, 13, 14, 15. La migración a través de la barrera sangre-cerebro se lleva a cabo por la interacción de los linfocitos con las células endoteliales 14. En contraste a las células endoteliales en la periferia, las células endoteliales de la CNS expresan altas cantidades de moléculas de unión estrecha, con lo estrictamente limitando la cantidad de células y proteínas capaces de cruzar la barrera sangre-cerebrolass = &quot;xref&quot;&gt; 16. resultados inflamación en el aflojamiento de las uniones estrechas e induce la expresión de moléculas de adhesión; por lo tanto, la mejora de la migración de linfocitos en el SNC 1, 17, 18. La extravasación a través de la barrera sangre-cerebro es un proceso de múltiples pasos. Linfocitos de sujeción para las células endoteliales y luego rodar a lo largo del endotelio en un proceso mediado principalmente por las selectinas 1, 15. Posteriormente, las interacciones entre las quimiocinas secretadas por el endotelio y los respectivos receptores de quimioquinas expresados en los linfocitos inducen cambios conformacionales de las integrinas, promoviendo así la adhesión firme a las células endoteliales 1. Finalmente, los linfocitos o bien arrastre a lo largo de la barrera endotelial contra el flujo de sangre antes de transmigrando en el espacio perivascular, o detener inmediatamente y directamente transmigrate en el sitio de la firma de la adhesión 1, 19, 20. Todos estos pasos de extravasación de linfocitos pueden ser analizados in vitro usando técnicas distintas 21. Time-lapse microscopía de vídeo se utiliza para estudiar la inmovilización inicial y 15 de rodamiento. Ensayos de adhesión proporcionan información detallada acerca de la detención firme endoteliales barreras 22. Ensayos de transmigración como se demuestra aquí permiten el análisis de la transmigración de células inmune 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29. Uso de la humana en sangre modelo in vitro de barrera cerebro, recientemente hemos podido demostrar que un Migr mayorcapacidad Atory de CD56 CD16 brillante dim / - células NK en comparación con su CD56 dim CD16 + homólogos se reflejó por un predominio de este subconjunto de células NK en el compartimento intratecal 21. Por lo tanto, nuestra configuración experimental parece ser adecuado para imitar la situación in vivo.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>without CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; or MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Fibronectin 1 mg/mL</td><td>Sigma</td><td>F1141-5MG</td><td>from bovine plasma</td></tr><tr><td>T-25 cell culture flask</td><td>Greiner BioOne</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>HBMEC</td><td>ScienCell</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Pelobiotech</td><td>PB-H-6023</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ECM-b</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial cell growth supplement</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Corning</td><td>3472</td><td>clear, 6.5 mm diameter, 3.0 &amp;micro;m pore size</td></tr><tr><td>96-well flat bottom plate</td><td>Corning</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Evans blue</td><td>Sigma</td><td>E2129-10G</td><td>stock solution: 1 g/50 mL PBS</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>50x concentrated</td></tr><tr><td>Infinite M200Pro</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well black flat bottom plate</td><td>Greiner BioOne</td><td>675086</td><td></td></tr><tr><td>48-well plate</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Flow Count Fluorospheres</td><td>Beckman Coulter</td><td>7547053</td><td></td></tr><tr><td>Na-EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Gallios 10-color flow cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaluza 1.5a</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TNF-&amp;alpha;</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&amp;gamma;</td><td>Peprotech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>CD3-PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>300430</td><td>clone UCHT1</td></tr><tr><td>CD56-PC7</td><td>Beckman Coulter</td><td>A21692</td><td>clone N901</td></tr><tr><td>CD16-A750</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66330</td><td>clone 3G8</td></tr><tr><td>CD4-FITC</td><td>Biolegend</td><td>300506</td><td>clone RPA-T4</td></tr><tr><td>CD8-A700</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66332</td><td>clone B9.11</td></tr></tbody></table>

analysis of lymphocyte extravasation using an in vitro model of the human blood-brain barrier

extravasación de linfocitos en el sistema nervioso central (SNC) es fundamental para la vigilancia inmune. alteraciones relacionadas con la enfermedad de extravasación de linfocitos podrían dar lugar a cambios fisiopatológicos en el SNC. Por lo tanto, la investigación de la migración de linfocitos en el SNC es importante entender las enfermedades inflamatorias del sistema nervioso central y para desarrollar nuevos enfoques de terapia. Aquí presentamos un modelo in vitro de la barrera sangre-cerebro humano para estudiar la extravasación de linfocitos. células endoteliales microvasculares del cerebro humano (HBMEC) se cultivan confluently en un tereftalato de polietileno poroso transwell insertar para imitar el endotelio de la barrera sangre-cerebro. La función de barrera es validado por zonula occludens inmunohistoquímica, la resistencia eléctrica transendotelial (TEER) mediciones así como el análisis de evans permeación azul. Este modelo permite la investigación de la diapedesis de los subgrupos de linfocitos raros tales como CD56 CD16 brillante dim / - las células NK. Ademmineral, los efectos de otras células, citocinas y quimiocinas, alteraciones relacionadas con la enfermedad, y regímenes de tratamiento distintos sobre la capacidad migratoria de los linfocitos puede ser estudiado. Por último, el impacto de los estímulos inflamatorios, así como diferentes regímenes de tratamiento en la barrera endotelial pueden ser analizados.

Se muestran los resultados representativos que muestran transmigración de las células NK y subconjuntos de células T utilizando el hematoencefálica modelo de barrera humana (Figura 1A). La integridad de la monocapa HBMEC fue validado por tinción de la molécula de unión estrecha mediciones de resistencia eléctrica transendotelial (TEER) ZO-1, y evans permeación azul (Figura 1B). Después de 3 - 4 días de cultivo HBMEC expresa la molécula de unión estrecha ZO-1 (Figura 1B, izquierda). Además, HBMEC creció en monocapas que exhiben resistencia transendotelial eléctrica (Figura 1B medio), así como la reducción de la permeación para azul de Evans (Figura 1B, derecha). HBMEC monocapas se utilizaron para estudiar la transmigración de las células NK incluyendo CD56 CD16 brillante dim / - y CD56 dim CD16 + subconjuntos de células NK y células T, incluyendo las células como dos ex CD4 + y CD8 + Tamples (Figura 1D + E, respectivamente). El porcentaje de células migradas se calculó basándose en los recuentos de células obtenidos por citometría de flujo y normalizados fluoroesferas usando recuento de flujo como un control interno (Figura 1C). La monocapa HBMEC se estimuló con IFN-γ y TNF-α 24h antes del ensayo para imitar las condiciones inflamatorias. la estimulación de citoquinas resultó en aumento de la migración de todas las poblaciones de linfocitos analizados. Esto podría ser debido a un aumento de la expresión de moléculas de adhesión incluyendo ICAM-1 (datos no mostrados). CD56 CD16 brillante dim / - células NK mostraron una capacidad migratoria superior en comparación con su CD56 dim CD16 + NK a través de ambos no estimulada (10,88% vs. 0,86%) y IFN-γγ / TNF-α estimulado (18,22% vs. 2,94%) HBMEC (Figura 1D). Sin embargo, el aumento relativo de la transmigración como resultado de la inflamación fue mayor para el CD56 dim CD16 + </sup&gt; subconjunto de células NK (+ 342% frente a + 167% para CD56 CD16 brillante dim / -). Estos resultados imitan las observaciones in vivo que CD56 CD16 brillante dim / - las células NK se enriquecen en el compartimento intratecal. Por lo tanto, el modelo de barrera hematoencefálica parece ser adecuado para analizar principios básicos de la diapedesis de células inmune de las poblaciones de linfocitos raros en el SNC 21. Por último, la capacidad transmigratoria de CD4 y CD8 subconjuntos de células T se muestra (Figura 1E). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55390/55390fig1.jpg" /> Figura 1: migración diferencial de los subconjuntos de células NK a través de no inflamada e inflamada HBMEC monocapas. A. Una imagen de insertos transwell (izquierda) y la ilustración de la configuración experimental (derecha). B. Validación de las funciones de barrera HBMEC. Izquierda: tinción inmunohistoquímica de la mol unión estrechaecule ZO-1 de conejo anti-humano ZO-1 (Abcam, 1: 200) y de cabra anti-IgG de conejo-Cy3 (1: 300) en HBMEC cultivado durante 3 días. Centro: resistencia transendotelial eléctrica (TEER) de HBMEC entre el día 2 y el día 4 de cultivo. Derecha: curva estándar para evans permeación azul para HBMEC con la estimulación ( &quot;inflamado&quot;, rojo) o sin ( &quot;no inflamada&quot;, negro) con 500 U / ml de IFN-γ y TNF-α por 24 horas. ensayos de transmigración se llevan a cabo 72 - 96 horas después de la siembra de la HBMEC (flecha negro). CE. PBMC derivado de 16 individuos sanos se sometieron a ensayos de migración como se describe en la sección de protocolo. 24 h antes del ensayo, la mitad de los insertos de cultivo de células se estimularon con 500 UI / ml de IFN-γ y TNF-α. se recogieron las células transmigradas y se analizaron por citometría de flujo. C. Resultados representativos para PBMC derivan desde el control in vitro bien (parte superior) y después de la migración a través de HBMEC no inflamada (parte inferior). cel NK<html> ls fueron cerrada a partir de linfocitos totales como CD3 - células CD56 + y distingue además en CD56 CD16 brillante dim / - ( &quot;CD56 brillante &quot;) y CD56 dim CD16 + (&quot; CD56 dim&quot;) subconjuntos de células NK. fluoroesferas de recuento de flujo ( &quot;perlas&quot;) fueron cerrada basado en FSC características / SSC y se determinó su número en un FL3 frente al tiempo. Cálculos a modo de ejemplo para determinar el porcentaje de células CD56 brillante y CD56 dim NK migradas se muestran a la derecha. D. Porcentaje de células NK migrados, así como CD56 brillante y CD56 subconjuntos de células NK tenue, y E. porcentaje de células T migrado incluyendo CD4 + y subconjuntos de células T CD8 + siguientes transmigración a través de no inflamada (negro) o inflamada (rojo) HBMEC representa como media ± SEM. Los valores de P se calcularon mediante la prueba t de Student pareado; ** p &lt;0,01, *** p &lt;0,001./ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55390/55390fig1large.jpg&quot; target = &#39;_ blank&#39;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Análisis de linfocitos extravasación El uso de una<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de la barrera sangre-cerebro humano

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

20.3K vistas.  University Hospital Münster. Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro. 

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Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Método mejorado para la preparación de una base de células, Contacto Modelo Humano de la barrera hematoencefálica

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Investigación

Bioingeniería

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

Establecimiento de un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de Rata barrera hematoencefálica (BBB): Un Enfoque en la acreditación Impermeabilidad y transporte mediado por los receptores

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Medicina

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de la barrera sangre-cerebro mediante Espectroscopia de Impedancia: Un enfoque en la interacción de células T de la célula endotelial

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Inmunología e Infección

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of non-essential ions and toxic substances. Tight junctions (TJ) effectively seal the paracellular space in the monolayers resulting in an intact barrier. This study describes a LY-based fluorescence assay that can be used to determine its apparent permeability coefficient (Papp) and in turn can be used to determine the kinetics of the formation of confluent monolayers and the resulting tight junction barrier integrity in hCMEC/D3 monolayers. We further demonstrate an additional utility of this assay to determine TJ functional integrity in transfected cells. Our data from the LY Papp assay shows that the hCMEC/D3 cells seeded in a transwell setup effectively limit LY paracellular transport 7 days-post culture. As an additional utility of the presented assay, we also demonstrate that the DNA nanoparticle transfection does not alter LY paracellular transport in hCMEC/D3 monolayers.

We present a fluorescence assay to demonstrate that Lucifer Yellow (LY) is a robust marker to determine the apparent paracellular permeability of hCMEC/D3 cell monolayers, an in vitro model of the human blood-brain barrier. We used this assay to determine the kinetics of a confluent monolayer formation in cultured hCMEC/D3 cells.

Lucifer Yellow - Un marcador de permeabilidad paracelular robusto en un modelo celular de la barrera hematoencefálica humana

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...

Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex vivo transmigration system. Group 2 innate lymphoid cells (ILC2) and CD4+ T helper cells were isolated from spleens and lungs of chicken egg ovalbumin (OVA)-challenged BALB/c mice. We confirmed the expression of CCR4 on both CD4+ T cells and ILC2, comparatively. CCL17 and CCL22 are the known ligands for CCR4; therefore, using this ex vivo transmigration method we examined CCL17- and CCL22-induced movement of CCR4+ lymphocytes. To establish chemokine gradients, CCL17 and CCL22 were placed in the bottom chamber of the transmigration system. Isolated lymphocytes were then added to top chambers and over a 48 h period the lymphocytes actively migrated through 3 &#181;m pores towards the chemokine in the bottom chamber. This is an effective system for determining the chemokinetics of lymphocytes, but, understandably, does not mimic the complexities found in the in vivo organ microenvironments. This is one limitation of the method that can be overcome by the addition of in situ imaging of the organ and lymphocytes under study. In contrast, the advantage of this method is that is can be performed by an entry-level technician at a much more cost-effective rate than live imaging. As therapeutic compounds become available to enhance migration, as in the case of tumor infiltrating cytotoxic immune cells, or to inhibit migration, perhaps in the case of autoimmune diseases where immunopathology is of concern, this method can be used as a screening tool. In general, the method is effective if the chemokine of interest is consistently generating chemokinetics at a statistically higher level than the media control. In such cases, the degree of inhibition/enhancement by a given compound can be determined as well.

In this protocol, lymphocytes are placed in the top chamber of a transmigration system, separated from the bottom chamber by a porous membrane. Chemokine is added to the bottom chamber, which induces active migration along a chemokine gradient. After 48 h, lymphocytes are counted in both chambers to quantitate transmigration.

Evaluación de la migración de linfocitos en un sistema de transmigración ex Vivo

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...

Análisis de modelos de barrera hematoencefálica mediante tinción de inmunofluorescencia

Use of the MicroSiM (&#181;SiM) Barrier Tissue Platform for Modeling the Blood-Brain Barrier

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, the&#160;&#181;SiM provides experimentalists with new capabilities, including live cell imaging, unhindered paracrine signaling between &#39;blood&#39; and &#39;brain&#39; chambers, and the ability to directly image immunofluorescence without the need for the extraction/remounting of membranes. Here we demonstrate the basic use of the platform to establish monoculture (endothelial cells) and co-culture (endothelial cells and pericytes) models of the BBB using ultrathin nanoporous silicon-nitride membranes. We demonstrate compatibility with both primary cell cultures and human induced pluripotent stem cell (hiPSC) cultures. We provide methods for qualitative analysis of BBB models via immunofluorescence staining and demonstrate the use of the &#181;SiM for the quantitative assessment of barrier function in a small molecule permeability assay. The methods provided should enable users to establish their barrier models on the platform, advancing the use of tissue chip technology for studying human tissues.

Autor destacado: Avanzando en el uso de la tecnología de chips de tejido para el estudio de tejidos humanos 

This report provides protocols for assembly, cell culture, and assays on the &#181;SiM platform for the construction of blood-brain barrier models.

Uso de la plataforma de tejido de barrera MicroSiM (μSiM) para modelar la barrera hematoencefálica

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, ...

<meta charset="utf8"></head><body>Visualización basada en colorantes fluorescentes de la ruptura de la barrera hematoencefálica en ratones

Evaluation of Blood-Brain Barrier Breakdown in a Mouse Model of Mild Traumatic Brain Injury

Fluorescent dyes are used to determine the extent of dye extravasation that occurs due to blood-brain barrier (BBB) breakdown. Labeling with these dyes is a complex process influenced by several factors, such as the concentration of dyes in the blood, permeability of brain vessels, duration of dye extravasation, and reduction in dye concentration in the tissue due to degradation and diffusion. In a mild traumatic brain injury model, exposure to blast-induced shock waves (BSWs) triggers BBB breakdown within a limited time window. To determine the precise sequence of BBB breakdown, Evans blue, and fluorescein isothiocyanate-dextran were injected intravascularly and intracardially into mice at various time points relative to BSW exposure. The distribution of dye fluorescence in brain slices was then recorded. Differences in the distribution and intensity between the two dyes revealed the spatiotemporal sequence of BBB breakdown. Immunostaining of the brain slices showed that astrocytic and microglial responses correlated with the sites of BBB breakdown. This protocol has broad potential for application in studies involving different BBB breakdown models.

<meta charset="utf8"></head><body>Evaluación de la ruptura de la barrera hematoencefálica en un modelo de ratón de lesión cerebral traumática leve

A method was developed to visualize dye extravasation due to blood-brain barrier (BBB) breakdown by administering two fluorescent dyes to mice at different time points. The use of glycerol as a cryoprotectant facilitated immunohistochemistry on the same sample.

Evaluación de la ruptura de la barrera hematoencefálica en un modelo de ratón de lesión cerebral traumática leve

Fluorescent dyes are used to determine the extent of dye extravasation that occurs due to blood-brain barrier (BBB) breakdown. Labeling with these dyes is ...

Análisis de linfocitos extravasación El uso de una

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Método mejorado para la preparación de una base de células, Contacto Modelo Humano de la barrera hematoencefálica

Establecimiento de un

Un

Lucifer Yellow - Un marcador de permeabilidad paracelular robusto en un modelo celular de la barrera hematoencefálica humana

Evaluación de la migración de linfocitos en un sistema de transmigración ex Vivo

Uso de la plataforma de tejido de barrera MicroSiM (μSiM) para modelar la barrera hematoencefálica

Uso de la plataforma de tejido de barrera MicroSiM (μSiM) para modelar la barrera hematoencefálica

Uso de la plataforma de tejido de barrera MicroSiM (μSiM) para modelar la barrera hematoencefálica

Evaluación de la ruptura de la barrera hematoencefálica en un modelo de ratón de lesión cerebral traumática leve

Evaluación de la ruptura de la barrera hematoencefálica en un modelo de ratón de lesión cerebral traumática leve