This research was funded by the Office of Naval Research through Core funds provided to the Naval Research Laboratory.

1. Preparación de los plásmidos <ol><li> Preparar un plásmido (por ejemplo, pET22) que contiene la proteína de anclaje (OmpA) fusionado a un dominio de ligamiento biorthogonal (denominado en el presente Protocolo como ancla-ST), etiqueta de epítopo (por ejemplo, 6xHis, etiquetas myc o FLAG para la purificación e identificación), periplásmico etiqueta de localización, resistencia a los antibióticos, y de origen adecuada de la replicación basada en la cepa bacteriana seleccionada 7. <ol><li> Extraer el ADN plasmídico a partir de cultivos de una noche usando un kit de aislamiento de ADN disponibles comercialmente siguiendo el protocolo del fabricante. </li></ol></li><li> Preparar un plásmido (por ejemplo, pACYC184) que contiene la enzima / proteína (PTE) para ser empaquetados dentro de la OMV fusionado con el dominio de ligamiento bioorthogonal complementaria a la de la proteína de anclaje (denominado en el presente protocolo como enzima-SC), etiqueta de epítopo, etiqueta periplasmic localización, resistencia a los antibióticos que es diferente que el plásmido proteína de anclaje, y orig apropiadoen la replicación basado en la cepa bacteriana seleccionada 7. <ol><li> Extraer el ADN plasmídico a partir de cultivos de una noche usando un kit de aislamiento de ADN disponibles comercialmente siguiendo el protocolo 7 del fabricante. </li></ol></li></ol> 2. Generación de una OMV Packaging E. coli Cultura <ol><li> aislamiento del plásmido <ol><li> Purificar plásmidos que codifican la enzima-SC construir y anclaje-ST construye a partir de líneas celulares de mantenimiento separadas utilizando un kit de aislamiento de plásmido comercial según el protocolo del fabricante 7. Determinar la concentración de ADN y la pureza mediante la medición de la absorbancia a 260 nm y 280 nm. </li></ol></li><li> Co-transformación <ol><li> Seleccione una cepa de E. coli que está disponible comercialmente para facilitar la expresión de proteínas. NOTA: BL21 células se utilizaron aquí (DE3). Se requiere que el lisógeno T7 para expresión de la construcción de anclaje-ST, que se basa en el promotor T7 y la ARN polimerasa T7 para protein expresión. El uso de otras cepas bacterianas requiere o bien la presencia del gen lisógeno T7 o el uso de un plásmido que no sea pET22 7. </li><li> Diluir plásmido de ADN purificado a concentraciones molares equivalentes luego transformarlas en células bacterianas competentes a través de ya sea el calor de transformación de choque o la electroporación siguiendo el protocolo del fabricante para las células competentes elegidos. </li><li> células de la placa transformada Onto Luria-Bertani (LB) placas de agar con ampicilina (pET22) y cloranfenicol (pACYC184) que contiene los antibióticos; ambos presentes a concentraciones finales de 25 mg / ml. </li><li> Coloque la placa de cultivo a 37 ° C durante la noche para aislar sólo los clones que contienen ambos plásmidos. NOTA: Las colonias que sobreviven a la selección de antibióticos se utilizan para todas las futuras preparaciones de OMV. Antibióticos (ampicilina y cloranfenicol) se añadirán a todos los cultivos líquidos para mantener la presión selectiva y asegurar la presencia de ambos plásmidos. </li></ol></li></ol> 3. Producción de OMV <ol><li> expansión de la colonia <ol><li> Inocular 5 ml de medio de cultivo (típicamente Caldo Terrific (TB) o LB) que contenía antibióticos a las concentraciones mencionadas anteriormente (etapa 2.2.3) con una sola colonia de las placas de selección descritos en 2.2.4. </li><li> Realizar una dilución 1: 100 veces del cultivo iniciador durante la noche en frascos de cultivo con deflectores. NOTA: Utilice un volumen de medios de comunicación entre 250-500 ml. </li><li> Mantener el cultivo a 37 ° C con agitación a 250 rpm para asegurar que la aireación suficiente de la cultura se alcanza. </li></ol></li><li> La inducción de cada plásmido <ol><li> Deje que el cultivo de bacterias para crecer hasta una DO600 de 0,6-0,8, aproximadamente 3 horas después de la inoculación del crecimiento del matraz crecimiento primario. </li><li> Para mejorar el rendimiento final de vesículas cargadas PTE-SC, centrifugar todo el cultivo a 7.000 xg durante 15 min. Resuspender el sedimento celular en la pre-calentado, medios de cultivo fresco. NOTA: Este optional paso ayuda a eliminar cualquier OMV vacío que están presentes en el medio de cultivo antes de la inducción PTE-SC. </li><li> Hacer una solución madre 20% de L-arabinosa en agua y filtro estéril utilizando un filtro de 0,22 micras. Almacenar la solución de L-arabinosa a 4 ° C durante 2-4 semanas. </li><li> Añadir la solución de L-arabinosa al matraz de cultivo a una concentración final 0,2% para iniciar la producción PTE-SC. NOTA: Esto ayuda a cargar previamente el espacio periplásmico con PTE-SC antes de la promoción de una mayor formación de vesículas través de la inducción de la mutante OmpA-ST. </li><li> Hacer una solución 1 M isopropílico β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) en agua y filtro estéril utilizando un filtro de 0,22 micras. NOTA: IPTG debe ser utilizado inmediatamente una vez hidratado. Alícuotas de IPTG se pueden almacenar congeladas durante 3-6 meses y se pueden descongelar inmediatamente antes de su uso. </li><li> Añadir IPTG después de un período de incubación de 3 horas adicionales a una concentración final de 0,5 mM para iniciar la producción de la OmpA-ST. </li><li> Permitir que el cultura de crecer para un 8-14 h adicionales a 37 ° C con agitación. </li></ol></li></ol> 4. Purificación OMV <ol><li> La eliminación de bacterias intactas <ol><li> Centrifugar los medios de cultivo bacteriano durante 15 minutos a 7000 xga 4 ° C para sedimentar las bacterias intactas. </li><li> Se decanta, y guardar, los medios de comunicación fuera de la parte superior del poste centrifugación sedimento celular con cuidado de no perturbar el sedimento celular. </li><li> Repetir los pasos 4.1.1 y 4.1.2 para un ciclo de centrifugación adicional para asegurar que todas las bacterias intactas se retiran de los medios de cultivo asegurándose de decantar y guardar los medios de comunicación. </li></ol></li><li> La eliminación de agregados de proteínas <ol><li> purificar adicionalmente el medio de cultivo bacteriano utilizando un filtro de 0,45 micras de membrana para eliminar las bacterias residuales y el material celular grande no deseado. NOTA: Utilice un material de membrana biológicamente compatible para mayores recuperaciones y menor absorción de proteínas, tales como acetato de celulosa (CA) o difluoruro de polivinilideno (PVDF). volúmenes filtro de jeringa de menos de 100 ml y los volúmenes de filtro de vacío de más de 100 ml. <ol><li> Para filtro de jeringa, extraer el medio de cultivo en jeringa estéril de 10-50 ml. Adjuntar 0,45 micras filtro a extremo Luer de la jeringa. Presionando el émbolo y recoger de flujo continuo en un buque nuevo. </li><li> Para aspirar filtro, transferir medio de cultivo a un aparato de filtración estéril. Coloque la unidad de la bomba de vacío o se hundirá aspirador para generar succión. Transferir medio filtrado a la nueva embarcación. </li></ol></li></ol></li><li> Aislamiento de OMV a través de ultracentrifugación <ol><li> Añadir los medios de cultivo filtrado en tubos de centrifugación teniendo cuidado de equilibrar tubos opuestas en la centrífuga. </li><li> Pellet a ~ 150.000 xg durante 3 horas a 4 ° C en una ultracentrífuga mediante el rotor correspondiente a juego tanto el instrumento y tubos que se utilizan. </li><li> Se decanta el medio de cultivo agotado OMV a partir del sedimento OMV, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento de OMV, inmediatamente a la terminación of centrifugación como permitir que el sedimento OMV a permanecer en los medios de comunicación se ablandará el sedimento de la reducción de la recuperación de OMV. NOTA: Este pellet será ligeramente marrón y dependiendo de la cantidad de partida de cultivo bacteriano puede o no ser visible a simple vista. De aspiración de los medios de comunicación directamente desde la parte superior del tubo de centrifugación es también una opción teniendo en cuenta que los medios de comunicación más retiradas de la OMV sedimentar las más pura será la muestra final OMV. </li><li> Guardar el sobrenadante se centrifuga para las pruebas más adelante dispersión dinámica de luz (DLS) para verificar que las partículas de OMV estaban completamente agotados de los medios de comunicación. </li><li> Añadir 0,5 a 1 ml de pH 7,4 o mM N 100 tampón estéril filtrada Phosphate Buffered Saline (PBS) ciclohexil-2-aminoetanosulfónico ácido (CHES) a pH 8,0 al sedimento OMV lo que le permite incubar durante 30 min a TA. Asegúrese de que la pastilla no se seque. NOTA: Los extremos en la concentración de la solución iónica, el pH y la temperatura puede dar lugar a una solubilidad reducida OMV y promover agregación. </li><li> pipetear cuidadosamente la solución OMV purifica a partir del tubo de centrífuga, mezclando suavemente para asegurar la totalidad de la pastilla ha sido solubilizado. </li></ol></li></ol> 5. Caracterización de OMV <ol><li> Utilizar cualquier software DLS o el seguimiento de nanopartículas disponibles comercialmente siguiendo los protocolos del fabricante proporcionado únicos para cada instrumento para determinar la distribución del tamaño de partícula y la concentración de OMV. NOTA: En este caso, se determinó la distribución del tamaño de OMV y la concentración de la utilización de nanopartículas NanoSight LM10 de seguimiento y software de análisis NTA 2.3. <ol><li> Abra el software. </li><li> Encienda el microscopio y limpiar todas las superficies de la unidad de microscopio y el seguimiento de las nanopartículas. </li><li> Añadir ~ 0,5 ml de muestra de OMV directamente a la ventana de visualización del dispositivo de rastreo de partículas a través del adaptador Luer con una jeringa estéril de 1 ml asegurándose de cubrir toda la ventana de visualización sin inyectar burbujas de aire en el sistema. </li><li> lugar tque nanopartícula unidad de seguimiento sobre la platina del microscopio y encender el láser. </li><li> Haga clic en &quot;Capture&quot; en el software. </li><li> Ajuste el enfoque del microscopio y la etapa de visualizar las partículas en la pantalla de vista previa presente en la ventana del software. </li><li> Ajuste el &quot;obturador de la cámara&quot; y &quot;ganancia de la cámara&quot; hasta que las partículas brillantes se visualizan claramente en un fondo oscuro. </li><li> Ajustar la duración de la captura hasta 60 seg. </li><li> Haga clic en &quot;Grabar&quot;. </li><li> Cuando se le solicite, introduzca la temperatura / dispositivo de muestra, etiquetar la muestra, y guardar los datos de vídeo al final de la cada funcionar en una carpeta designada por el usuario. </li><li> Mantenga todos los parámetros de análisis (detección de umbral, la falta de definición, Pista longitud mínima, que se espera Min Tamaño de Partículas) en Modo de detección automática y haga clic en &quot;secuencia del proceso.&quot; NOTA: Consulte el manual de cómo cada parámetro se puede ajustar de forma independiente a los resultados de análisis de sintonía fina. </li><li> Registro de partícula y distribución de tamaño de partículas / mconcentración de L como se determina por el software. NOTA: Un rango de tamaño hidrodinámico OMV típico es entre 30-200 nm con una concentración de partículas / ml de ~ 10 x 10 8. </li></ol></li><li> Determinar el contenido de proteína OMV <ol><li> Utilice estándar SDS-PAGE y los protocolos de transferencia de Western para evaluar la pureza OMV, la producción de la enzima, y la eficacia de reticulación SC-ST 7. NOTA: La reticulación eficiencia no será 100% 7. </li></ol></li></ol> 6. Verificación de enzima Packaging <ol><li> Ensayo de la actividad PTE <ol><li> Realizar todos los ensayos enzimáticos en un tampón adecuado, tal como 100 mM de tampón CHES (pH 8) a 25 ° C, ya sea en una cubeta o multiplexados en una placa de 96/384 también. </li><li> Añadir 5 l de una dilución 1: 1000 de paraoxón en tampón CHES 90 l de CHES y 5 l de OMV purificado (~ 36 veces concentrado en comparación con la concentración de OMV presente en el medio de cultivo). Precaución: paraoxón es un pesticida tóxicoy debe ser manejado por el fabricante y las directrices institucionales. </li><li> Tomar las lecturas de absorbancia a intervalos regulares (cada 20 segundos durante ~ 2 horas de tiempo de reacción total) a 405 nm (ε = 18,1 mM -1 cm -1) y 348 nm (ε punto isosbéstico = 5,4 mM -1 cm -1) a controlar la progresión de reacción del producto de la descomposición paraoxón cromogénico, p-nitrofenol. NOTA: A valores de pH por encima de 8 está presente la forma desprotonada dominante de p-nitrofenol lo que permite un seguimiento preciso a 405 nm. En todas las demás soluciones de pH complejo o inferior, es necesario utilizar el punto de 348 nm isosbéstico como múltiples formas de la p-nitrofenol estarán presentes. </li><li> Calcular las velocidades iniciales de reacción mediante la determinación de la pendiente de la porción lineal de las curvas de progreso de la etapa 6.1.3 para comparar la cantidad relativa de PTE en cada muestra, la eficiencia de embalaje, y la producción total de PTE. </li><li> Realizar enzimática estándarprotocolos de ensayo para determinar la K M, V max y kcat para el OMV encapsulados PTE. NOTA: Un análisis de Lineweaver-Burk puede ser utilizado para la determinación de estos parámetros cinéticos en la intersección y = 1 / V máx y la pendiente max = 20 K M / V. </li></ol></li><li> Transmembrana Substrato / difusión del producto. <ol><li> Realizar el mismo análisis ensayo cinético descrito en el paso 6.1 utilizando concentraciones crecientes de Triton X-100 en tampón CHES de 0-3% en volumen. NOTA: La adición de Triton X-100 a las funciones de OMV solubilizados para interrumpir la bicapa lipídica permitiendo de los contenidos de la OMV a ser libremente accesible a la solución de reacción. </li><li> Calcular y comparar las velocidades iniciales en cada nivel de Triton X-100 para verificar el paso transmembrana del sustrato / producto indicado por el cambio mínimo en la actividad de la enzima (velocidades iniciales) en comparación con la actividad enzimática in la ausencia de Triton X-100. Si se observa un aumento sustancial de la actividad enzimática en presencia de Triton X-100, es probable que el sustrato no se difunde libremente en la OMV. </li><li> actividad de la enzima libre de ensayo (como se describe anteriormente en la sección 6.1) en presencia de Triton X-100 para verificar que la actividad de la enzima no es inhibida por el propio agente tensioactivo. NOTA: Si la actividad se ve afectada en gran medida por Triton X-100, aditivos alternativos, tales como saponinas o varios polisorbato / tensioactivos de interpolación pueden ser más adecuados para romper la membrana OMV. </li></ol></li></ol> 7. Almacenamiento OMV <ol><li> Congelación <ol><li> alícuotas lugar ~ 100 l de OMV purificada directamente en nitrógeno líquido para congelar las alícuotas complemento asegurándose de no sumergir totalmente los viales o ponerse en contacto con cualquier nitrógeno líquido con la propia muestra. NOTA: Purified OMV puede congeló directamente en la memoria intermedia que fue seleccionado para solubilizar el precipitado OMV durante el purificatproceso de ion sin crioprotectores adicionales necesarios 7. </li><li> Almacenar las alícuotas se congelaron rápidamente a -80 ° C. </li><li> Descongelar alícuotas congeladas procedentes de la etapa 7.1.1 colocándolos a temperatura ambiente asegurándose de no calentar las muestras. </li><li> Antes de preparar todas las muestras para el almacenamiento de esta manera realizar el ensayo enzimático descrito en la etapa 6.1 la comparación de velocidades iniciales antes y después de la congelación para verificar que no hay pérdida significativa en la actividad de la enzima poste de congelación-descongelación. NOTA: tienda purificó OMV a 4 ° C si se observa una reducción en la actividad enzimática debido a la congelación. </li></ol></li><li> La liofilización <ol><li> Liofilizar las alícuotas se congelaron rápidamente VME purificadas utilizando equipos de liofilización disponible en el mercado 21. </li><li> Tienda liofilizado alícuotas a temperatura ambiente durante semanas o a -80 ° C durante muchos meses. </li><li> Añadir el mismo volumen de agua purificada a la OMV liofilizado como antes de la liofilización y dejar reposar a temperatura ambiente durante 30 min para rehidratar tse muestra. Mezclar suavemente cuando sea necesario asegurarse de no Vortex o sonicar la OMV. </li><li> Agregue el polvo liofilizado OMV directamente al punto de atención para aplicaciones donde antes de dilución / solubilización no es necesario. </li></ol></li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-Intein+for+simultaneous+site-specific+conjugation+of+quantum+dots+to+multiple+protein+targets+in+vivo.">Split-Intein for simultaneous site-specific conjugation of quantum dots to multiple protein targets in vivo.</a> J. Nanobiotechnol. 9, 1-14 (2011).</li><li>Lee, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+proteomic+profiling+of+native+outer+membrane+vesicles+derived+fromEscherichia+coli.">Global proteomic profiling of native outer membrane vesicles derived fromEscherichia coli.</a> Proteomics. 7, 3143-3153 (2007).</li><li>Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protecting+enzymatic+function+through+directed+packaging+into+bacterial+outer+membrane+vesicles.">Protecting enzymatic function through directed packaging into bacterial outer membrane vesicles.</a> Sci. Rep. 6, 24866 (2016).</li><li>Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+therapeutic+delivery+capabilities+and+challenges+utilizing+enzyme/protein+packaged+bacterial+vesicles.">Emerging therapeutic delivery capabilities and challenges utilizing enzyme/protein packaged bacterial vesicles.</a> Ther. Delivery. 6, 873-887 (2015).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este funciones de protocolo para demostrar un representante dirigidas técnica de embalaje en el que se produce y se empaqueta en OMV por E. coli una enzima de interés. Al igual que con muchas técnicas complejas hay varias áreas en las que el protocolo puede ser modificado para adaptarse a su uso en diferentes aplicaciones únicas, algunas de las cuales se detallan a continuación. Si bien el mecanismo de envases OMV y la encapsulación de la enzima se puede adaptar a las necesidades específicas hay varios ...

Se presenta aquí un método para el diseño, la producción y purificación de vesículas de enzimas cargadas bacterianas de membrana externa (OMV). OMV son pequeños, principalmente unilamelar, proteoliposomas que varían en tamaño desde 30 hasta 200 nm de 1,2. Todas las bacterias Gram-negativas y Gram-positivas que han sido estudiados hasta la fecha han demostrado la liberación de cualquiera de las OMV o vesículas extracelulares (EV) de su superficie de 3,4. El mecanismo exacto por el cual se producen OMV aún no se han aclarado por completo debido a las diversas poblaciones bacterianas que ellos, así como las diferentes funciones que sirven secretan. OMV se ha demostrado que el transporte de una amplia gama de carga a partir de moléculas pequeñas, péptidos y proteínas al material genético que sirve una variedad de complejo de señalización, la translocación de genes, y la virulencia funciones 5,6. Los mecanismos exactos de la biogénesis OMV no están bien caracterizadas, y parecen diferir entre especies bacterianas. A pesar de this hecho, hemos desarrollado un método para mejorar la eficacia de empaquetamiento de una proteína recombinante en OMV mediante la creación de una unión sintética entre una proteína de interés y una proteína muy abundante endógena a la membrana externa bacteriana y la posterior OMV. En ausencia de un enlace sintético, o afinidad constituida artificialmente, entre la proteína expresada de forma recombinante y la OMV la eficacia de empaquetamiento observada es muy bajo 7. Este resultado es de esperar que la incorporación de las proteínas dentro de la OMV se produce ya sea a través de la encapsulación azar en el preciso momento de la formación de OMV en la superficie bacteriana o por medio de envasado dirigido por mecanismos que no se comprenden bien. Algunos éxito se ha observado en el envasado de proteínas simplemente a través de más de expresión dentro del espacio periplásmico que se basa en la encapsulación azar pero el envase eficaz es altamente dependiente de la proteína con algunas proteínas de envasado a alta eficiencia en comparación con otros tha no empaquetar en absoluto 8-10. Mediante la utilización de técnicas de biología sintética comunes hemos tratado de diseñar Escherichia coli (E. coli) para producir al mismo tiempo, el paquete y segregan una enzima activa de interés en OMV que elude las limitaciones del conocimiento actual acerca de cómo se forman y cómo OMV de carga es seleccionada por las bacterias para embalaje. Para los fines de esta solicitud se seleccionó un sistema de bioconjugación proteína de división como la unión sintética de elección para facilitar el embalaje direccional en la OMV. Como el nombre sugiere un sistema bioconjugation proteína de división se compone de dos dominios de subunidades complementarios que interactúan entre sí. Los dominios de la proteína de división seleccionados para los fines de este protocolo se conocen como la SpyCatcher (SC) y SpyTag dominio (ST) y se derivan de la proteína de unión a fibronectina pyogenes Streptococcus-(FbaB) 11. Este sistema de la proteína de división es inusual en que wuando las dos subunidades están dentro de la proximidad de un enlace isopeptide forma espontáneamente entre los extremos proximal aspártico residuos de ácido de ácidos y aminoácidos lisina que crean una unión covalente. Formación de enlaces isopeptídicos no requiere la adición de proteínas chaperonas, enzimas catalíticas, o cofactores y puede ocurrir fácilmente a temperatura ambiente (RT) y en un amplio rango de condiciones fisiológicamente relevantes 12. Como prueba de concepto, se seleccionó fosfotriesterasa (PTE) (EC 3.1.8.1) de Brevundimonas diminuta para ser envasados en E. coli derivado OMV 13. PTE contiene un sitio activo Zn / Zn binuclear y tiene la capacidad de descomponer los fosfatos orgánicos a través de una reacción de hidrólisis convertir aryldialkylphosphates en dialquilfosfatos y alcoholes de arilo 14. La exposición a los organofosfatos afecta la función del neurotransmisor adecuada a través de la inhibición de la hidrólisis de la acetilcolina por la acetilcolinesterasa en las uniones neuromusculares Makincompuestos derivados organofosforados g extremadamente peligrosas 15. La exposición prolongada o significativa a organofosforados habitualmente da lugar a convulsiones incontrolables y por lo general causa la muerte a través de la asfixia. Mientras PTE exhibe la actividad catalítica más alta hacia paraoxón, un muy potente insecticida, también es capaz de hidrolizar una amplia gama de otros pesticidas y agentes nerviosos química V / G de tipo 16. Para facilitar el empaquetamiento OMV, un plásmido bacteriano fue diseñado que codifica una construcción génica que contiene un promotor inducible, una secuencia de localización periplásmica, y un corto sitio de clonación múltiple aguas arriba de la secuencia del gen SC. La inserción del gen PTE entre el líder y la secuencia SC permitido para la creación de un interruptor genético que se dirige a la proteína de fusión PTE-SC al espacio periplásmico para el envasado de OMV. Si bien los esfuerzos descritos aquí se centran en PTE, el gen de la enzima es intercambiable y fácilmente podría ser reemplazada con otra secuencia de gen a FACilitate envasado de una enzima o proteína alternativa. A medida que la segunda parte de la ligamiento sintético, se elige una proteína de membrana externa abundante (OmpA) para presentar la secuencia del péptido ST. Si bien la elección de la proteína de anclaje puede variar, es esencial que la proteína tiene un dominio permisivo que presenta dentro del espacio periplásmico, tolera la construcción de fusión sin inducir citotoxicidad, se sabe que está presente en OMV, y no agregar cuando es recombinante producida. OmpA es una proteína transmembrana kDa porin 37.2 que se sabe que está altamente expresado en la membrana externa bacteriana y la posterior OMV 17. Se está implicada en el transporte de moléculas pequeñas, &lt;2 nm de tamaño, a través de la membrana bacteriana 18. Nativo OmpA tiene dos dominios estructuralmente únicos, un motivo de barril beta transmembrana y una porción C-terminal periplasmically soluble conocido para interactuar con el peptidoglicano 19. En el designe de fusión OmpA-ST mutanted aquí se ha eliminado la porción C-terminal de OmpA y el ST se fusionó a la N- frente periplasmically o C-terminales. La eliminación de la porción periplásmico de OmpA disminuye el número de interacciones entre la membrana exterior y el peptidoglicano que resulta en la desestabilización de la membrana que conduce a la hiper-7 vesiculación. Genomic OmpA se mantuvo además de la construcción de OmpA-ST expresado de forma recombinante para mitigar la desestabilización de membrana bruta.

<table><tbody><tr><td>IPTG</td><td>Any</td><td></td><td>Always prepare fresh or aliquot and freeze.</td></tr><tr><td>L-arabinose</td><td>Any</td><td></td><td>Can be prepared ahead of time and stored at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Any</td><td></td><td>Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Chloramphenicol&amp;nbsp;</td><td>Any</td><td></td><td>Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TB/LB Culture Media</td><td>Any</td><td></td><td>Other growth medias will likely work similarly.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Any</td><td></td><td>One of many potential suitable surfactants.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Baffled culture flasks</td><td>Any</td><td></td><td>The baffles promote higher levels of aeration.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CHES</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP318-100</td><td>Optimal buffer used for paraoxon degredation (pH &gt; 8).</td></tr><tr><td>Paraoxon</td><td>Chem Service</td><td>N-12816</td><td>Very toxic substance to be handled carefully and disposed of properly.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Syringe Filter 0.45 &amp;micro;m</td><td>Thermo Scientific</td><td>60183-221 (30 mm)</td><td>Filter diameter will depend on volume of sample. Low protein binding membrane is critical.</td></tr><tr><td>Shaker incubator</td><td>New Brunswick</td><td>Excella E24</td><td>Precise temperature and mixing is essential for reproducable bacterial growth.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sorvall Culture Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>RC 5B PLUS</td><td>Large volume (500 ml) culture centrifuge capable of 7,000 x g.</td></tr><tr><td>Sorvall Ultracentrifuge&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>WX Ultra 90</td><td>Capable of centrifugal forces &amp;ge;150,000 x g.</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Rotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>AH-629</td><td>Ensure the proper rotor and tubes are used and that everything is properly balanced.</td></tr><tr><td>Ultra-Clear Ultracentrifuge Tubes (25 x 89 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td>Ensure no stress fractures are present prior to use and that tubes are presicely balanced.</td></tr><tr><td>Spectrophotometer&amp;nbsp;</td><td>Tecan</td><td>Infinite M1000</td><td>Necessary for enzyme kinetic assays.</td></tr><tr><td>DLS/particle tracking</td><td>NanoSight&amp;nbsp;</td><td>LM10</td><td>Necessary for OMV size distribution and concentration determination.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BL21(DE3)</td><td>NEB</td><td></td><td>Suitable bacterial expression strain.</td></tr><tr><td>pET22</td><td>EMD Millipore</td><td>69744-3</td><td>Other plasmids can be used in place of these.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>pACYC184</td><td>NEB</td><td></td><td>Other plasmids can be used in place of these.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Example kit.</td></tr></tbody></table>

directed protein packaging within outer membrane vesicles from escherichia coli: design, production and purification

Un creciente interés en la aplicación de técnicas de biología sintética para programar vesículas de membrana externa (OMV) están dando lugar a algunas aplicaciones muy interesantes y únicos para los OMV en nanopartículas tradicionales están resultando demasiado difícil de sintetizar. Hasta la fecha, todas las bacterias Gram-negativas se han demostrado para producir envases que demuestra OMV de una variedad de carga que incluye moléculas pequeñas, péptidos, proteínas y material genético. Sobre la base de su diversa carga, OMV están implicados en muchos procesos biológicos que van desde la comunicación célula-célula para la transferencia de genes y la entrega de factores de virulencia, dependiendo de que las bacterias están produciendo la OMV. Sólo recientemente se han vuelto accesibles para su uso en una amplia gama de aplicaciones a través del desarrollo de técnicas para controlar y envasado directa de proteínas recombinantes en bacterias OMV OMV. Este protocolo describe un método para la producción, purificación, y el uso de la enzima de envasados ​​OMV proporcionar para mejorar la overall producción de la enzima recombinante, el aumento de vesiculación, y la estabilidad de la enzima mejorada. la utilización con éxito de este protocolo dará lugar a la creación de una cepa bacteriana que a la vez produce una proteína recombinante y la dirige para OMV de encapsulación a través de la creación de una unión sintética entre la proteína recombinante y una proteína de anclaje a la membrana externa. Este protocolo también se detallan los métodos para el aislamiento de OMV a partir de cultivos bacterianos, así como las técnicas apropiadas de manipulación y cosas para considerar cuando la adaptación de este protocolo para su uso en otras aplicaciones únicas, tales como: entrega de medicamentos, el diagnóstico médico, y la remediación ambiental.

La expresión simultánea de dos proteínas recombinantes, como se requiere para la estrategia de embalaje OMV se detalla en este protocolo, se puede lograr a través de un número de diferentes vías. Aquí, un sistema de dos vector se utilizó con orígenes de replicación compatibles y casetes de genes inducibles por separado. Para la expresión de la PTE-SC construir un plásmido comercial columna vertebral (pACY184) fue diseñado para incluir un casete de gen inducible de arabinosa ...

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Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

Dirigida Packaging de proteínas dentro de la membrana externa de vesículas de<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Diseño, Producción y Purificación

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

directed-protein-packaging-within-outer-membrane-vesicles-from

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

13.3K vistas.  Naval Research Laboratory. A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented. 

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Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a target for future development of inhibitors to decrease the virulence of the pathogen. To perform biophysical and structural characterization as well as inhibitor screening, large amounts of pure and active protein will be needed. We have developed a protocol for efficient production and purification of PPEP-1 by the use of E. coli as the expression host yielding sufficient amounts and purity of protein for crystallization and structure determination. Additionally, using microseeding, highly intergrown crystals of PPEP-1 can be grown to well-ordered crystals suitable for X-ray diffraction analysis. The methods could also be used to produce other recombinant proteins and to study the structures of other proteins producing intergrown crystals.

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is a secreted metalloprotease and promising drug-target from the human pathogen Clostridium difficile. Here we describe all methods necessary for the production and structure determination of this protein.

Producción, Cristalización y determinación de la estructura de<em&gt; C. difícil</em&gt; PPEP-1 a través de microsiembra y Zinc-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

Investigación

Bioquímica

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% percent of known structures. There are two types of membrane proteins, &#945;-helical and &#946;-barrel. While &#945;-helical membrane proteins can be found in nearly all cellular membranes, &#946;-barrel membrane proteins can only be found in the outer membranes of mitochondria, chloroplasts, and Gram-negative bacteria. One common bottleneck in structural studies of membrane proteins in general is getting enough pure sample for analysis. In hopes of assisting those interested in solving the structure of their favorite &#946;-barrel outer membrane protein (OMP), general protocols are presented for the production of target &#946;-barrel OMPs at levels useful for structure determination by either X-ray crystallography and/or NMR spectroscopy. Here, we outline construct design for both native expression and for expression into inclusion bodies, purification using an affinity tag, and crystallization using detergent screening, bicelle, and lipidic cubic phase techniques. These protocols have been tested and found to work for most OMPs from Gram-negative bacteria; however, there are some targets, particularly for mitochondria and chloroplasts that may require other methods for expression and purification. As such, the methods here should be applicable for most projects that involve OMPs from Gram-negative bacteria, yet the expression levels and amount of purified sample will vary depending on the target OMP.

&#946;-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of &#946;-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.

A partir de construcciones de Cristales - Hacia la determinación de la estructura de la β-barril proteínas de membrana externas

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

Química

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be greatly facilitated by the production of milligram amounts of pure, folded ligand binding domains. Attempts to heterologously express periplasmic ligand binding domains of bacterial chemoreceptors in Escherichia coli (E. coli) often result in their targeting into inclusion bodies. Here, a method is presented for protein recovery from inclusion bodies, its refolding and purification, using the periplasmic dCACHE ligand binding domain of Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 as an example. The approach involves expression of the protein of interest with a cleavable His6-tag, isolation and urea-mediated solubilisation of inclusion bodies, protein refolding by urea depletion, and purification by means of affinity chromatography, followed by tag removal and size-exclusion chromatography. The circular dichroism spectroscopy is used to confirm the folded state of the pure protein. It has been demonstrated that this protocol is generally useful for production of milligram amounts of dCACHE periplasmic ligand binding domains of other bacterial chemoreceptors in a soluble and crystallisable form.

A procedure is presented for the refolding of the dCACHE periplasmic ligand binding domain of Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 from inclusion bodies and the purification to yield milligram quantities of protein.

Método para Refolding eficiente y la purificación del quimioreceptor ligando vinculante dominio

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine exchangers in plants have not been identified. Here, we outline a method to characterize polyamine antiporters using membrane vesicles generated from the lysis of Escherichia coli cells heterologously expressing a plant antiporter. First, we heterologously expressed AtBAT1 in an E. coli strain deficient in polyamine and arginine exchange transporters. Vesicles were produced using a French press, purified by ultracentrifugation and utilized in a membrane filtration assay of labeled substrates to demonstrate the substrate specificity of the transporter. These assays demonstrated that AtBAT1 is a proton-mediated transporter of arginine, &#947;-aminobutyric acid (GABA), putrescine and spermidine. The mutant strain that was developed for the assay of AtBAT1 may be useful for the functional analysis of other families of plant and animal polyamine exchangers. We also hypothesize that this approach can be used to characterize many other types of antiporters, as long as these proteins can be expressed in the bacterial cell membrane. E. coli is a good system for the characterization of novel transporters, since there are multiple methods that can be employed to mutagenize native transporters.

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

We describe a method for the characterization of proton-driven membrane transporters in membrane vesicle preparations produced by heterologous expression in E. coli and lysis of cells using a French press.

Caracterización de transportadores de membranas por expresión heteróloga en E. coli y producción de vesículas de membrana

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins that have incorporated functional domains derived from nature (or created de novo) have been reported. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins have been developed; these aECM proteins consist of biological domains taken from fibronectin, laminins and collagens and are combined with structural domains including elastin-like repeats, silk and collagen repeats. To date, aECM proteins have been widely investigated for applications in tissue engineering and wound repair. Recently, Tjin and coworkers developed integrin-specific aECM proteins designed for promoting human skin keratinocyte attachment and propagation. In their work, the aECM proteins incorporate cell binding domains taken from fibronectin, laminin-5 and collagen IV, as well as flanking elastin-like repeats. They demonstrated that the aECM proteins developed in their work were promising candidates for use as substrates in artificial skin. Here, we outline the design and construction of such aECM proteins as well as their purification process using the thermo-responsive characteristics of elastin.

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technologies have enabled material designers to create novel artificial proteins with customized functionalities for tissue engineering applications. For example, artificial extracellular matrix proteins can be designed to incorporate structural and biological domains derived from native ECMs. Here, we describe the construction and purification of aECM proteins containing elastin-like repeats.

Diseño y Construcción de Artificial matriz extracelular (AECM) Las proteínas de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Para la piel Ingeniería de Tejidos

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

Bioingeniería

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity of cells within a test tube. By obviating the need to maintain the viability of the cell, and by eliminating the cellular barrier, CFPS has been foundational to emerging applications in biomanufacturing of traditionally challenging proteins, as well as applications in rapid prototyping for metabolic engineering, and functional genomics. Our methods for implementing an E. coli-based CFPS platform allow new users to access many of these applications. Here, we describe methods to prepare extract through the use of enriched media, baffled flasks, and a reproducible method of tunable sonication-based cell lysis. This extract can then be used for protein expression capable of producing 900 &#181;g/mL or more of super folder green fluorescent protein (sfGFP) in just 5 h from experimental setup to data analysis, given that appropriate reagent stocks have been prepared beforehand. The estimated startup cost of obtaining reagents is $4,500 which will sustain thousands of reactions at an estimated cost of $0.021 per &#181;g of protein produced or $0.019 per &#181;L of reaction. Additionally, the protein expression methods mirror the ease of the reaction setup seen in commercially available systems due to optimization of reagent pre-mixes, at a fraction of the cost. In order to enable the user to leverage the flexible nature of the CFPS platform for broad applications, we have identified a variety of aspects of the platform that can be tuned and optimized depending on the resources available and the protein expression outcomes desired.

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

This protocol details the steps, costs, and equipment necessary to generate E. coli-based cell extracts and implement in vitro protein synthesis reactions within 4 days or less. To leverage the flexible nature of this platform for broad applications, we discuss reaction conditions that can be adapted and optimized.

Escherichia coli-base libres de células síntesis de la proteína: protocolos para una tecnología de plataforma robusta, flexible y accesible

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity ...

Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro

Tailored proteinaceous building blocks are versatile candidates for the assembly of supramolecular structures such as minimal cells, drug delivery vehicles and enzyme scaffolds. Due to their biocompatibility and tunability on the genetic level, Elastin-like proteins (ELP) are ideal building blocks for biotechnological and biomedical applications. Nevertheless, the assembly of protein based supramolecular structures with distinct physiochemical properties and good encapsulation potential remains challenging.
Here we provide two efficient protocols for guided self-assembly of amphiphilic ELPs into supramolecular protein architectures such as spherical coacervates, fibers and stable vesicles. The presented assembly protocols generate Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) based on ELPs with adaptable physicochemical properties. PMBCs demonstrate phase separation behavior and reveal method dependent membrane fusion and are able to encapsulate chemically diverse fluorescent cargo molecules. The resulting PMBCs have a high application potential as a drug formulation and delivery platform, artificial cell, and compartmentalized reaction space.

At the interface of organic and aqueous solvents, tailored amphiphilic elastin-like proteins assemble into complex supramolecular structures such as vesicles, fibers and coacervates triggered by environmental parameters. The described assembly protocols yield Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) with tunable properties, enabling the encapsulation of various cargo.

Montaje dirigido de proteínas similares a la elastina en estructuras supramoleculares definidas y encapsulación de carga in Vitro

Tailored proteinaceous building blocks are versatile candidates for the assembly of supramolecular structures such as minimal cells, drug delivery ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identificación de los complejos de proteínas en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; La purificación mediante afinidad del péptido secuencial en combinación con espectrometría de masas tándem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Biología

Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization

The use of confocal microscopy as a method to assess peptide localization patterns within bacteria is commonly inhibited by the resolution limits of conventional light microscopes. As the resolution for a given microscope cannot be easily enhanced, we present protocols to transform the small rod-shaped gram-negative Escherichia coli (E. coli) and gram-positive Bacillus megaterium (B. megaterium) into larger, easily imaged spherical forms called spheroplasts or protoplasts. This transformation allows observers to rapidly and clearly determine whether peptides lodge themselves into the bacterial membrane (i.e., membrane localizing) or cross the membrane to enter the cell (i.e., translocating). With this approach, we also present a systematic method to characterize peptides as membrane localizing or translocating. While this method can be used for a variety of membrane-active peptides and bacterial strains, we demonstrate the utility of this protocol by observing the interaction of Buforin II P11A (BF2 P11A), an antimicrobial peptide (AMP), with E. coli spheroplasts and B. megaterium protoplasts.

Here we present a protocol to produce gram-negative Escherichia coli (E. coli) spheroplasts and gram-positive Bacillus megaterium (B. megaterium) protoplasts to clearly visualize and rapidly characterize peptide-bacteria interactions. This provides a systematic method to define membrane localizing and translocating peptides.

Producción y visualización de Esferoplastos bacterianos y protoplastos para caracterizar la localización de péptido antimicrobiano

The use of confocal microscopy as a method to assess peptide localization patterns within bacteria is commonly inhibited by the resolution limits of ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules derived from the parental cells. EVs function as intra- and inter-species communication vectors while also contributing to the interaction between bacteria and host organisms in the context of infection and colonization. Given the multitude of functions attributed to EVs in health and disease, there is a growing interest in isolating EVs for in vitro and in vivo studies. It was hypothesized that the separation of EVs based on physical properties, namely size, would facilitate the isolation of vesicles from diverse bacterial cultures. 
The isolation workflow consists of centrifugation, filtration, ultrafiltration, and size-exclusion chromatography (SEC) for the isolation of EVs from bacterial cultures. A pump-driven tangential flow filtration (TFF) step was incorporated to enhance scalability, enabling the isolation of material from liters of starting cell culture. Escherichia coli was used as a model system expressing EV-associated nanoluciferase and non-EV-associated mCherry as reporter proteins. The nanoluciferase was targeted to the EVs by fusing its N-terminus with cytolysin A. Early chromatography fractions containing 20-100 nm EVs with associated cytolysin A - nanoLuc were distinct from the later fractions containing the free proteins. The presence of EV-associated nanoluciferase was confirmed by immunogold labeling and transmission electron microscopy. This EV isolation workflow is applicable to other human gut-associated gram-negative and gram-positive bacterial species. In conclusion, combining centrifugation, filtration, ultrafiltration/TFF, and SEC enables scalable isolation of EVs from diverse bacterial species. Employing a standardized isolation workflow will facilitate comparative studies of microbial EVs across species.

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Bacteria secrete nanometer-sized extracellular vesicles (EVs) carrying bioactive biological molecules. EV research focuses on understanding their biogenesis, role in microbe-microbe and host-microbe interactions and disease, as well as their potential therapeutic applications. A workflow for scalable isolation of EVs from various bacteria is presented to facilitate standardization of EV research.

Aislamiento escalable y purificación de vesículas extracelulares de Escherichia coli y otras bacterias

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Dirigida Packaging de proteínas dentro de la membrana externa de vesículas de

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Producción, Cristalización y determinación de la estructura de