Name: simultaneous assessment of cardiomyocyte dna synthesis and ploidy: a method to assist quantification of cardiomyocyte regeneration and turnover
Uploaded: 2016-05-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
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This work was supported by the British Heart Foundation, project grant PG/13/69/30454.

el trabajo con animales fue autorizado y aprobado por el comité de revisión ética de la Universidad de Newcastle. Todos los procedimientos con animales se realizaron conforme a las líneas de la Directiva 2010/63 / UE del Parlamento Europeo sobre la protección de los animales utilizados para fines científicos. 1. Administración EdU <ol><li> Disolver EdU en solución salina estéril (0,9% w / v) a una concentración final de 12,5 mg / ml. <ol><li> Calentar la solución a 40 ° C y agitar para disolver completamente. Almacenar suficiente EDU / solución salina a 4 ° C para inyectar todos los ratones en el estudio lo que permite 6 inyecciones diarias. Nota: Por lo general se requieren más de 6 ratones para cada grupo experimental. Sin embargo, los cálculos de potencia se deben realizar para estudios independientes. </li></ol></li><li> Pesar ratones individuales. Calcular el volumen necesario para administrar 100 mg / g de solución / solución salina EdU a cada ratón (8 l de solución madre EdU por g). </li><li> Dibujar el volum apropiadae del EDU / solución salina en jeringa de insulina con una aguja de 25 G. </li><li> Realizar intraperitoneal (ip) durante la manipulación de los ratones usando técnicas del Ministerio del Interior aprobados. <ol><li> Coloque el ratón en la tapa de la jaula. Tire suavemente de nuevo en la base de la cola y sujete firmemente el ratón por la piel. </li><li> Exponer el abdomen para inyección Manteniendo el ratón con el dedo índice y el pulgar cerca de la base de la cabeza e inclinando la cabeza del animal hacia atrás hacia el piso. </li><li> Limpiar el abdomen con una solución de alcohol 70%. Localiza la línea media del animal y en el cuadrante inferior derecho. Se inyecta la solución EDU / solución salina en el animal en el cuadrante inferior derecho. </li><li> Inyectar ratones con solución / solución salina EdU y registrar la hora del día. </li></ol></li><li> Repetir los pasos 1.2 a 1.4 en el mismo momento del día, durante 6 días consecutivos. Nota: A medida que se requiere un control negativo EdU para ajustar la compuerta para el análisis de citometría de flujo, inyectar una edad adicional, el género y experimentalmente que coincidaed ratón con un volumen equivalente de solución salina sin edu. Esto proporcionará el control requerido (ningún control EDU). Este control debe ser incluido para cada estudio para permitir variaciones en los lotes de reactivos y citómetro configurado. </li></ol> 2. Los corazones de cosecha <ol><li> A las 24 h después de la inyección EdU 6º, sacrificar a los ratones por dislocación cervical (o un horario alternativo 1 de Ministerio del Interior aprobó el método). </li><li> Lugar de los animales sacrificados en una posición supina y hacer incisión en la piel desde el centro del abdomen hasta el diafragma con tijeras quirúrgicas. </li><li> Cortar el diafragma, y ​​sosteniendo el esternón lejos de la cavidad del cuerpo, corte bilateralmente para exponer el corazón. </li><li> Levantar ligeramente el corazón y cortar los principales vasos sanguíneos del tracto de salida para diseccionar el corazón fuera de la cavidad torácica. </li><li> Inmediatamente colocar el corazón en cada una de 15 ml tubo de centrífuga individual que contiene 10 ml de PBS enfriado a 4 ° C. </li><li> Transferir los corazones a SEParate 10 cm placas de Petri, utilizando un escalpelo cortar cada corazón en dos en una orientación sagital y lavar el corazón apretando suavemente con un par de fórceps. A continuación, reemplace el PBS para eliminar la mayor cantidad de sangre posible. Repita este paso dos veces. </li><li> Coloque ambas partes de cada corazón en el mismo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml individual. </li><li> Continúe con el paso 3 o, alternativamente, almacenar las muestras -80 ° C como se detalla en los pasos 2.9 y 2.10. </li><li> Usando una aguja 25 G, hacer un pequeño agujero en la tapa del tubo de microcentrífuga para evitar que la tapa de apertura debido a la expansión de los gases cuando se procesa el corazón. </li><li> Etiqueta de cada tubo de microcentrífuga y colocar en un contenedor de nitrógeno líquido para congelar. </li></ol> Etiquetado 3. Los núcleos de disociación de los cardiomiocitos y Núcleos Nota: Este etiquetado de disociación y cardiomiocitos núcleos núcleos es una adaptación de la de Bergmann et al 11 Realice este procedimiento en todas las muestras inyectadas.con Edu y solución salina inyectada (sin control de EDU) control negativo. Ver Tabla 1 para la receta de soluciones que se requieren para llevar a cabo estos pasos. <ol><li> Para cada corazón para ser analizada, colocar 36 ml de 1% de BSA / PBS solución en un tubo de ultracentrífuga, se incuba durante 30 minutos, desechar la solución y luego dejar secar al aire. Nota: Este tubo se utiliza en el paso 3.6. </li><li> Coloque los corazones congelados individuales sobre una placa de 10 mm en el hielo y carne picada con un bisturí que permite a los corazones se descongelan durante el proceso de picar carne. </li><li> Coloque corazones picado en 15 ml de Tampón de Lisis Celular en un tubo de centrífuga de 50 ml y homogeneizar con un homogeneizador de sonda para 15 segundos a 25.000 rpm a temperatura ambiente. </li><li> Añadir otros 15 ml de Tampón de Lisis Celular al tubo de centrífuga y transferir a un 40 ml Dounce con una mano de mortero grande despacho. Realizar 10 golpes con la mano del mortero y filtrar a través de 100 micras a continuación colador 40 micras de células en un tubo de centrífuga de 50 ml. </li><li> Se centrifuga durante 10 minutos unat 700 xga 4 ° C y separar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el sedimento nuclear en 25 ml de sacarosa solución de gradiente y la capa de los núcleos celulares solución en la parte superior de 10 ml de solución de gradiente de sacarosa fresco en el tubo de ultracentrífuga preparado en 3.1 que contienen. </li><li> Centrifugar a 13.000 xg durante 1 hora a 4 ° C usando un rotor de tubo de oscilación hacia fuera. </li><li> Tras la centrifugación, desechar el sobrenadante y resuspender el botón núcleos en 1.300 l de tampón de almacenamiento de núcleos en un tubo de 1.5 ml y etiqueta PCM1. </li><li> Eliminar 300 l de la suspensión a un nuevo tubo de microcentrífuga y añadir 700 l de tampón de almacenamiento núcleos fresco. Etiquetar este tubo como control ISO. </li><li> Añadir anti-PCM1 a una concentración final de 8 mg / ml al tubo de microcentrífuga etiquetado PCM1 y añadir el anticuerpo de control de isotipo IgG de conejo a una concentración de 8 mg / ml al tubo de microcentrífuga etiquetado de control ISO. </li><li> Incubar toda la noche a 4 ° C. Tras incubación, centrifugar a 700 xg durante 10 min, descartar el sobrenadante, sustituir con 1 ml de tampón de almacenamiento núcleos fresco, resuspender y centrifugar de nuevo durante 10 min a 700 x g. Descartar el sobrenadante y reemplazar con 1 ml de tampón de almacenamiento núcleos fresco. </li><li> Añadir 1 l de F (ab &#39;) 2 Fragmento de IgG de cabra anti-conejo (H + L) de anticuerpos (FITC o tinte verde fluorescente equivalente) para alcanzar una concentración final de 2 mg / ml. Nota: El uso de un F (ab &#39;) 2 fragmento de anticuerpo disminuye el potencial para el etiquetado no específica de las células inmunes incluyendo macrófagos y células B. </li><li> tubos de envoltura en papel de aluminio para protegerlo de la luz y se incuban durante 1 hora a 4 ° C. </li></ol> 4. Detección de EdU Incorporación <ol><li> Diluir 10 veces más concentrada EdU tampón de reacción 1:10 con agua desionizada. </li><li> Se centrifuga la PCM-1 e ISO suspensiones núcleos de control etiquetada a 700 xg durante 10 min, descartar el sobrenadante y resuspender el botón núcleos en 1 ml de1% de BSA / PBS solución. Lavar el sedimento de núcleos dos veces. </li><li> Después del lavado final, descartar el sobrenadante y reemplazar con 100 l de EdU fijador. </li><li> Envuelva los tubos en papel de aluminio para protegerlo de la luz y se incuba a temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Lavar las muestras dos veces con 1 ml de 1% BSA / PBS solución, centrifugar a 700 xg y se incuba con una solución de permeabilización a base de saponina 1x a temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Preparar 1x cóctel etiquetado EdU (Tabla 2). Se requerirá un mínimo de 2 reacciones de incluir el control edu. </li><li> Añadir 500 l de 1x cóctel EdU etiquetado directamente a cada muestra que ya contiene los núcleos en 100 l de solución de permeabilización a base de saponina 1X y se incuba a temperatura ambiente protegido de la luz durante 30 min. </li><li> Centrifugar a 700 xg y resuspender en 1 ml de 1% BSA / PBS y repetir este paso dos veces más. </li><li> Se centrifuga a 700 xg, desechar el sobrenadante y reemplazar con 400 l de solución de tinción de ADN (véase la Tabla de Materiales). </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td></tr><tr><td> 1. Tampón de Lisis Celular </td></tr><tr><td> 0,32 M de sacarosa </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl (pH = 8) </td></tr><tr><td> 5 mM CaCl 2 </td></tr><tr><td> acetato de magnesio 5 mM </td></tr><tr><td> EDTA 2,0 mM </td></tr><tr><td> EGTA 0,5 mM </td></tr><tr><td> DTT 1 mM </td></tr><tr><td> Solución Gradiente 2.Sucrose </td></tr><tr><td> 2,1 M de sacarosa </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl (pH = 8) </td></tr><tr><td> acetato de magnesio 5 mM </td></tr><tr><td> DTT 1 mM </td></tr><tr><td> 3. tampón de almacenamiento núcleos (NSB) </td></tr><tr><td> 0,44 M de sacarosa </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl (pH = 7,2) </td></tr><tr><td> KCl 70 mM </td></tr><tr><td> 10 mM de MgCl 2 </td></tr><tr><td> espermina 1,5 mM </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Núcleos ingredientes de la receta tampón de aislamiento para todos los tampones usados ​​en la sección de protocolo 3 (disociación núcleos y etiquetado núcleos de cardiomiocitos).. 5. Análisis de citometría de flujo Nota: Realizar la citometría de flujo en núcleos aislados como se describió previamente 7,11,15. <ol><li> En primer lugar, crear un gráfico que describe dispersión frontal (FSC) y dispersión lateral (SSC) para permitir la discriminación de los núcleos de los desechos (Figura 2A). </li><li> Crear un plan para discriminar los núcleos individuales de los agregados (Figura 2B) mediante el trazado de 4 &#39;, 6-diamino-2-fenilindol)) área (DAPI (3-405 / 450/50-A) respecto a la altura (33-405 / 450 / 50-H). garantizar that el 3-405 / 450/50-A de la señal se recoge en la escala lineal para permitir la correcta determinación del contenido de ADN. </li><li> Crear un gráfico que describe 488/535 / 30-A (PCM-1) frente al SSC y mostrar sólo los eventos de la puerta singlete creada en 5.2 con el fin de evaluar PCM-1 de expresión en la población singlete. </li><li> Ejecutar la muestra de control de isotipo a fin de establecer un PCM-1 puerta positivo (Figura 2C). Ejecutar una pequeña cantidad de PCM1 etiquetado de ejemplo para comprobar la PCM1 expresar la posición de la población y gating. </li><li> Crear un gráfico que describe SSC-A frente a 405/450 / 50-A (para detectar DAPI). En esta gráfica, pantalla sólo singlete Pcm1 núcleos que expresan, usando las puertas creadas en 5.3. Utilice esta parcela para crear una puerta jerárquico adicional que contiene sólo 2 N núcleos (Figura 2D). </li><li> Crear un gráfico que describe 488/535 / 30-A contra 1-633 / 660/20-A para permitir la identificación de etiquetado EdU de la población que expresa PCM1 cardiomiocitos. Mostrar sólo los núcleos que son singlete, P<html> CM1 + y 2N usando el gating anteriormente. </li><li> Muestra de corazón correr desde ningún control EdU para configurar la puerta EdU positivo (Figura 2E). Crear la puerta apropiada para las células EdU +. </li><li> Grabar y cuantificar singlete, 2N, núcleos PCM-1 que expresan las que han incorporado edu. </li><li> El cálculo de esta población como un porcentaje del total de singlete, PCM1 + núcleos. Esto proporcionará la velocidad de generación de núcleos neo-cardiomiocitos, durante el período de pulso EdU 7 días, como un porcentaje de núcleos totales cardiomiocitos. Nota: Como la unión a ADN DAPI es estequiométrica la intensidad de fluorescencia es proporcional a la cantidad de ADN. Determinar la ploidía en base a la intensidad de la / 450/50-A de la señal 405, como se ha descrito previamente 7. </li><li> Para evaluar la ploidía dentro de la población total de cardiomiocitos utilizar la trama establecida en 5,5 y un gating estrategia basada en la concentración de ADN 7. </li></ol>/files/ftp_upload/53979/53979fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2:. Ventana de medida para cuantificar la estrategia de cardiomiocitos EdU incorporación y ploidía (A) Los núcleos están discriminado de desechos basados ​​en la dispersión frontal (FSC) y dispersión lateral (SSC). (B) Se crea una puerta lineal y la población se identifica singlete núcleos basados ​​en el marcaje con DAPI y la altura 405/450/50 vs señal de zona. (C) gating fluorescente permite la separación de los núcleos de cardiomiocitos núcleos (PCM-1-positivo) y no cardiomiocitos (PCM-1-negativos) de tejido del corazón. (D) La intensidad de la señal DAPI se utiliza para determinar la concentración de ADN y la ploidía de ese modo los núcleos de la población de los cardiomiocitos PCM1 +. En el ratón&gt; 80% de los núcleos de cardiomiocitos son diploide (2n). (E) gating fluorescente permite la separación de 2 N, núcleos de cardiomiocitos que han incorporado EdU (PCM + / + EDU = 0,9%) a partir de 2 N, cardiomiocitos que no han incorporado EdU (PCM + educación). Todas las etapas se detallan en el protocolo 5.0. Ejemplo muestra de MDX -. / Y ratones en el fondo C57 / BL10 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53979/53979fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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The authors have nothing to disclose.

Para cuantificar con precisión el volumen de negocios de los cardiomiocitos y ensayos de regeneración deben distinguir entre la verdadera generación de cardiomiocitos y la división de ADN no productiva. Muchos estudios siguen ignorando estos hechos simplemente no productivas, la cuantificación de la proliferación de cardiomiocitos únicamente a través de la expresión de ciclina kinesis y marcadores del ciclo celular. Hasta la fecha, un único método que permite la cuantificación precisa de la rotación de los cardiomiocitos mientras que el control de estos eventos no productivos sigue siendo alusiva. En particular, sigue siendo difícil dar cuenta de los cardiomiocitos polyploidization que contribuye hasta ~ 65% de la replicación del ADN de los cardiomiocitos 13. Por lo tanto para ayudar en la cuantificación exacta de la generación de cardiomiocitos hemos desarrollado un protocolo que permite la cuantificación robusta de los tipos de núcleos de cardiomiocitos neo excluyendo la replicación del ADN que resulta en un incremento de ploidía. Aunque este protocolo puede no discriminación entre los géneros neo-cardiomiocitosción y cardiomiocitos bi-nucleación, que pueden ser utilizados rápidamente y calcular con precisión el límite superior (que representan el ploidía) de generación de cardiomiocitos. Por lo tanto, este protocolo proporciona una herramienta de evaluación para evaluar los posibles cambios en las tasas de generación de cardiomiocitos y polyploidization en modelos de enfermedad o para evaluar la eficacia de la terapéutica potencial. Una vez que los cambios en la velocidad de generación de núcleos neo-cardiomiocitos se identifican utilizando este protocolo estudios posteriores se pueden utilizar para determinar si esto debido a cambios en la generación de cardiomiocitos de número de cardiomiocitos de nucleación, como se describió anteriormente 2,13,17,18. Estos incluyen el uso de la dinámica de nucleación cuantificación cardiomiocitos histológicos durante el período de pulso o análisis de secciones de tejido obtenidos a partir de animales EdU pulsados ​​en comparar EdU incorporación en las poblaciones de cardiomiocitos mononucleadas y multinucleadas. Debido a los bajos niveles de los cardiomiocitos rotación de esteprotocolo utiliza múltiples inyecciones de EdU lo largo de un período de 7 días. Esto también permite que la &quot;persecución&quot; de todas las posibles fuentes celulares de la generación de cardiomiocitos y permite la cuantificación de la generación de cardiomiocitos núcleos acumulada durante este período de tiempo. Dependiendo del estudio, este periodo de tiempo se puede ajustar para adaptarse a los niveles predichos de generación de cardiomiocitos. Para la cuantificación exacta de EdU incorporación en los núcleos de cardiomiocitos, es imperativo que no hay etiquetado no específica de los núcleos con el anticuerpo secundario usado para detectar PCM-1 reactividad. Por tanto, sería prudente para llevar a cabo experimentos de titulación de anticuerpos secundarios adicionales con el fin de optimizar este aspecto del protocolo, en particular si un anticuerpo secundario que no sea que se sugiere en este protocolo se va a usar. El protocolo descrito aquí utiliza PCM-1 de expresión para identificar los núcleos de cardiomiocitos. Si bien este es un marcador de cardiomiocitos establecido, marcadores alternativos se pueden utilizar para validardatos; estos incluyen anticuerpos específicos para la troponina T cardiaca que se ha identificado como parte localizada en los núcleos de cardiomiocitos 1. Del mismo modo, las proteínas localizadas nucleares alternativos pueden ser utilizados para identificar y cuantificar EdU incorporación en las poblaciones de núcleos distintos de los de los cardiomiocitos. Es importante que todos los núcleos de cardiomiocitos que están experimentando activamente mitosis se excluyen del análisis, ya que se desconoce el destino de esta síntesis de ADN y puede resultar en la división celular o el aumento de ploidía. PCM1 se desmonta durante la fase M del ciclo celular, por lo tanto cardiomiocitos mitosis no será identificado por la expresión PCM1. Además, todos los núcleos en la fase s del ciclo celular deben ser excluidos de análisis posteriores. Esto se puede lograr por Supresión todos los núcleos con una intensidad DAPI por encima de la población 2N incluyendo aquellos con una intensidad DAPI entre el 2N y 4N poblaciones. Aunque es cada vezaceptado que el corazón tiene la capacidad de sustituir los cardiomiocitos durante el envejecimiento normal y después de una lesión aguda, la fuente y el grado de este potencial sigue siendo controvertido. Además, las tasas dispares de rotación de los cardiomiocitos se han reportado 1,7,20-22. Esto puede ser debido en parte a las dificultades en la identificación y la cuantificación de la generación de neo-cardiomiocitos 19 con precisión. Hasta la fecha la mayoría de los estudios se han basado sólo en el uso del análisis histológico y la identificación de los cardiomiocitos a través de la expresión de proteínas citoplasmáticas, incluyendo proteínas del sarcómero, para la cuantificación del volumen de negocio de los cardiomiocitos y la renovación 2,4,23,24. El uso de estos métodos para detectar la expresión de marcadores de proliferación, o como se ha demostrado aquí, la incorporación de análogos de timidina puede resultar fácilmente en el error de identificación de otros tipos de células cardiaca como cardiomiocitos. Mientras que el uso de la imagen confocal 3D puede ayudar a aliviar estos problemas thESE métodos son caros y lentos. Curiosamente, el protocolo descrito aquí demuestra neo-cardiomiocitos generación núcleos se produce a un ritmo de 0,17% por semana. Esto es consistente con otra citometría de flujo que demuestran los estudios basados ​​tasas de rotación semanales de hasta 0,13% 5. Aunque es tentador para extrapolar las tasas de rotación anual sobre la base de estos datos, al igual que en estudios previos 2,5,25,26, esto no es apropiado como las tasas de rotación son dinámicos durante el tiempo de vida de un animal 13. Este método tiene un número de aplicaciones potenciales, incluyendo la evaluación de los agentes terapéuticos potenciales para mejorar la regeneración de los cardiomiocitos o la investigación de los efectos de la enfermedad cardiaca en el recambio de los cardiomiocitos y las tasas de polyploidization cardiomiocitos.

En los últimos años ha habido una acumulación de pruebas que cuestionan la suposición de que el corazón es un post-mitótico 1,2 de órganos terminales diferenciadas. Sin embargo, la cuantificación del volumen de negocios de los cardiomiocitos y la regeneración sigue siendo un reto. Las dificultades para identificar con precisión la generación de cardiomiocitos raras mediante técnicas de inmunohistoquímica estándar están bien reportaron 3. Además, la fuente celular de la generación de cardiomiocitos sigue siendo incierto con la evidencia para las contribuciones de la proliferación de los cardiomiocitos, así como por la diferenciación de células madre 4-6. Por lo tanto, el uso de modelos de linaje rastreo que requieren el conocimiento del fenotipo de cardiomiocitos progenitor es imposible y la cuantificación de la proliferación en una única población, incluyendo los cardiomiocitos, es inapropiado. Además un cardiomiocito tiene el potencial para endoreplication sin cariocinesis (que resulta en un coche poliploidediomyocyte) o cariocinesis en ausencia de la citocinesis (que resulta en un cardiomiocito binucleadas) 7,8. La cuantificación precisa de la rotación de los cardiomiocitos depende de la capacidad de distinguir entre estos eventos y la verdadera generación de neo-cardiomiocitos. Esto crea complicaciones únicas porque la replicación del ADN y la expresión de las quinasas dependientes de ciclina en cardiomiocitos no demuestran exclusivamente división celular verdadero 9,10. Para ayudar en la cuantificación de la generación de neo-cardiomiocitos, hemos combinado una técnica de aislamiento núcleos establecido, y el etiquetado inmunológica de material pericentriolar 1 (PCM1) para la identificación de los núcleos de cardiomiocitos como se describe por Bergmann et al. 7,11 con nuevos métodos de largo plazo marcaje de ADN y análisis de ploidía. PCM-1 es una proteína de centrosoma que se acumula en la superficie nuclear de diferenciados miocitos, no de ciclismo. Estudios previos han demostrado que los anticuerpos contraPCM-1 etiquetar específicamente núcleos de cardiomiocitos 7,11 y, como tal PCM1 ha sido utilizado por un número de grupos independientes para identificar los cardiomiocitos 1,12,13. Además, hemos demostrado que la expresión PCM1 asigna a núcleos de cardiomiocitos genéticamente etiquetados en el modelo CRE-TnT ratón transgénico 14 (Figura 1). El protocolo descrito aquí permite la identificación precisa y sensible de la generación de cardiomiocitos núcleos neo en el corazón de ratón, independientemente de los orígenes celulares (Figura 1A y B) mientras que excluye simultáneamente etiquetado nucleósido debido a polyploidization del análisis (Figura 1C y D). Aunque este método no puede controlar para binucleación cardiomiocitos, permite una cuantificación rápida y robusta de núcleos neo-cardiomiocitos que se requiere para la cuantificación precisa de la rotación de los cardiomiocitos. Además,proporciona una herramienta de detección rápida para evaluar los posibles cambios en la dinámica de generación de cardiomiocitos. Si bien el etiquetado de ADN implica generalmente 5-bromo-2&#39;-desoxiuridina (BrdU) como el análogo de la timidina, el protocolo descrito aquí utiliza un ensayo de 5-etinil-2 &#39;desoxiuridina (EDU), basado ya que requiere menos etapas de procesamiento para una más rápida a través de entradas y no requiere desnaturalización del ADN para la inmuno-detección, por lo que es compatible con otros protocolos de inmunotinción y aumentando así las posibles aplicaciones posteriores del método. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53979/53979fig1.jpg" /> Figura 1: pulsante continuo con etiquetas EdU neo-cardiomiocitos, independientemente de sus progenitores. (A) EdU se incorpora en el ADN de los cardiomiocitos durante la división celular. La proliferación de los cardiomiocitos en la población será Result en un aumento de, o la sustitución de los cardiomiocitos y es por lo tanto la síntesis de ADN productivo (contribuye al mantenimiento y reparación de tejidos). (B) EdU se incorpora en el ADN de las células progenitoras cardiacas durante la división celular. Este será retenido en la célula durante la diferenciación al linaje de los cardiomiocitos. Esta diferenciación de células madre también dará lugar a un aumento en el número de cardiomiocitos y por lo tanto contribuye al mantenimiento y reparación de tejidos. (C) Los cardiomiocitos tienen la posibilidad de someterse a la replicación del ADN &quot;no productivo&quot; que resulta en aumento de ploidía de los cardiomiocitos, que está asociada con la hipertrofia de los cardiomiocitos y la remodelación del miocardio, pero no sustituye a los cardiomiocitos perdidos. El proceso de polyploidization difiere de binucleación ya que resulta en una cardiomiocitos con un solo núcleo, que contiene cuatro o más conjuntos de dos cromosomas homólogos (&gt; 2N). (D) A raíz de una núcleos continua pUlse, este protocolo describe el aislamiento y la identificación de los núcleos de los núcleos de cardiomiocitos por expresión PCM1 para permitir la cuantificación de ambos ploidía de los cardiomiocitos y la incorporación EdU. PCM1 expresión y Edu incorporación detectado mediante citometría de flujo. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53979/53979fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>0.32 M sucrose</td><td>Sigma</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl (pH = 8)</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>5 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>c5086</td><td></td></tr><tr><td>5 mM magnesium acetate</td><td>sigma</td><td>M-5661</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mM EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mM EGTA</td><td>Sigma</td><td>63779</td><td></td></tr><tr><td>1 mM DTT</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>70 mM KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>10 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mM spermine</td><td>Sigma</td><td>85590</td><td></td></tr><tr><td>Isotype rabbit IgG- ChIP Grade</td><td>abcam</td><td>abc7415</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-PCM-1 antibody</td><td>Sigma</td><td>HPA023374</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 F(ab&#039;)2 Fragment of Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>A-11070</td><td></td></tr><tr><td>cell strainers&amp;nbsp; 70 &amp;mu;m and 100 &amp;mu;m&amp;nbsp;</td><td>Fisher scientific</td><td>11597522, 11517532</td><td></td></tr><tr><td>Glass dounce (40 ml) and pestle large clearance</td><td>Sigma</td><td>D9188-1SET</td><td></td></tr><tr><td>EdU (5-ethynyl-2&amp;rsquo;-deoxyuridine)</td><td>Life technologies</td><td>A10044</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit</td><td>Life technologies</td><td>C10634</td><td>This kit inlcudes&amp;nbsp; reagents required for section, EdU reaction buffer,&amp;nbsp; EdU fixative, saponin-based permeabilization solution and the reagents required for the EdU labelling cocktail.</td></tr><tr><td>CyStain DNA 2 step kit,</td><td>Sysmex Partec</td><td>05 5005</td><td>This kit inlcudes&amp;nbsp; reagents required for DAPI labelling (DNA staining solution)</td></tr><tr><td>Probe homogeniser, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, TissueRuptor</td><td>Qiagen</td><td>9001273</td><td></td></tr><tr><td>TissueRuptor Disposable Probes</td><td>Qiagen</td><td>990890</td><td></td></tr><tr><td>ultracentrifuge</td><td>Sorvall&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Facscanto II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Polypropylene. 38.5 ml, 25 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr></tbody></table>

simultaneous assessment of cardiomyocyte dna synthesis and ploidy: a method to assist quantification of cardiomyocyte regeneration and turnover

Aunque se acepta que el corazón tiene un potencial limitado para regenerar los cardiomiocitos después de la lesión y que los bajos niveles de rotación de los cardiomiocitos se producen durante el envejecimiento normal, la cuantificación de estos eventos sigue siendo un reto. Esto es en parte debido a la rareza del proceso y el hecho de que múltiples fuentes celulares contribuyen al mantenimiento del miocardio. Además, la duplicación del ADN dentro de los cardiomiocitos a menudo conduce a un cardiomiocito poliploides y sólo rara vez conduce a nuevos cardiomiocitos por división celular. Con el fin de cuantificar con precisión el volumen de negocios de los cardiomiocitos discriminación entre estos procesos es esencial. El protocolo descrito aquí emplea etiquetado nucleósido a largo plazo con el fin de etiquetar todos los núcleos que han surgido como resultado de la replicación del ADN y los núcleos de cardiomiocitos identificados mediante la utilización de aislamiento de núcleos y posterior immunolabeling PCM1. En conjunto, esto permite la identificación precisa y sensible del etiquetado nucleósido de la cardiomyocyte población núcleos. Además, 4 &#39;, el etiquetado y el análisis de la ploidía núcleos 6-diamidino-2-fenilindol, permite la discriminación de los núcleos neo-cardiomiocitos a partir de núcleos que han incorporado nucleósido durante polyploidization. Aunque este método no puede controlar para binucleación cardiomiocitos, permite una cuantificación rápida y robusta de núcleos neo-cardiomiocitos mientras que representa el polyploidization. Este método tiene una serie de aplicaciones posteriores, incluyendo la evaluación de los agentes terapéuticos potenciales para mejorar la regeneración de los cardiomiocitos o la investigación de los efectos de la enfermedad cardiaca en el recambio de los cardiomiocitos y la ploidía. Esta técnica también es compatible con las técnicas inmunohistoquímico aguas abajo adicionales, lo que permite la cuantificación de la incorporación de nucleósido en todos los tipos de células cardíacas.

Este método permite la cuantificación de aumento de la incorporación EdU debido a la división núcleos de cardiomiocitos mientras que el control para aumentar la polyploidization. El uso de un ensayo basado en BrdU, previamente demostrado que el corazón de los mamíferos responde a la pérdida de cardiomiocitos crónica, en el modelo de ratón mdx de distrofia muscular de Duchenne, con la regeneración de nuevos cardiomiocitos. Hemos utilizado los métodos descritos aquí para validar aún más nuestros resultados publicados y para demostrar la utilidad del protocolo. De acuerdo con el protocolo descrito; adultos (12 semanas de edad) ratones mdx BL10 y de control fueron pulsados ​​con una inyección diaria de EdU durante 7 días, informó anteriormente de forma estática para permitir el análisis entre los grupos experimentales 5,13. Análisis inmunohistoquímico de los corazones de impulsos demuestra la presencia de PCM1 expresar cardiomiocitos que han incorporado EdU (Figura 3A). usin Sin embargo, los datos obtenidosg inmunohistoquímico métodos pueden ser mal interpretados, como otros tipos de células que han incorporado EdU pueden ser identificados erróneamente como cardiomiocitos. Un ejemplo de esto se demuestra en la Figura complementario 1A y B. Además, los métodos inmunohistoquímico no distinguen polyploidization de la división nuclear. El análisis de citometría de flujo se detalla en este protocolo permite la rápida cuantificación de la división nuclear de cardiomiocitos en ratones mdx y de control, mientras que excluye células que habían incorporado EdU debido a polyploidization. Similar a los datos publicados previamente 13, el análisis reveló un aumento en las tasas de generación de núcleos neo-cardiomiocitos en los corazones de ratones mdx de edad en comparación con controles pareados (1,2% frente a 0,17%; Figura 3B y C). <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/53979/53979fig3.jpg" /> Figura 3: </strong&gt; Cuantificación de EdU etiquetado cardiomiocitos en corazones de tipo salvaje y mdx. (A) Imagen de proyecciones Z-stack tomadas de 40 micras de espesor secciones de corazones mdx. PCM-1 que expresan núcleos de cardiomiocitos (verde) que ha incorporado EdU (rojo). flecha amarilla indica EdU etiquetado cardiomiocitos. i y II indica individuo EdU etiquetado cardiomiocitos que se muestran en el plano z. Núcleos marcados con DAPI (azul) (B y C) Citometría de flujo de núcleos aislados mostrando parcelas representativas 12-13 de la semana viejo tipo salvaje (C57 / BL10) y los ratones mdx (MDX - / y en el fondo C57 / BL10). (B) Histograma que muestra la intensidad DAPI y la discriminación entre 2 N y 2N&gt; núcleos. (C) Las representaciones que muestran EdU incorporación en la población núcleos de cardiomiocitos 2N cuando se analizó como se detalla en este protocolo. Para todos los ratones Edu se administró durante 1 semana a partir de 12 semanas de edad. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53979/53979fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Complementario Figura 1:. PCM-1 es un marcador específico para los núcleos de cardiomiocitos utilizando el protocolo descrito núcleos fueron aislados del ratón transgénico doble producida mediante el cruce de ratones TNT cre-14 con la línea de reportero CRE sensible ROSA nT / nG 16. En la activación cre ratón resultante bajo el control de troponina T (TNT) promotor conduce a la expresión de GFP irreversible con se localiza en los núcleos. Núcleos marcados con el control de isotipo (Iso) demuestra la capacidad de identificar la expresión de GFP cardiomiocitos núcleos de población (488/530/30-A). Etiquetado de los núcleos con anti-PCM1 (anticuerpo secundario detectado por 633 a 660/20-A) demuestra la correlación de expresión PCM1 con el cardiomyocy expresan GFPpoblación núcleos te. En este ejemplo, el 98,8% de los núcleos de cardiomiocitos identificados por la actividad del promotor TNT, están marcadas por el anticuerpo PCM1. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure1.tif" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar la Figura 1 complementario.</a> Figura complementario. 2: Desafíos para la cuantificación de la renovación de los cardiomiocitos mediante técnicas inmunohistoquímico (A) 2D La imagen muestra dos PCM-1 que expresan núcleos de cardiomiocitos (verde) que parecen estar también marcado por Edu (rojo). Las flechas amarillas indican lo que parece ser cardiomiocitos que han incorporado edu. Esto es debido a la aparente co-localización de expresión PCM1 y etiquetado EdU cuando visualizado utilizando imágenes 2-dimensional. (B) Una proyección 3-dimensional de esta imagen identifica el EdU etiquetado células no son cardiomiocitos pero son células no cardiomiocitos suprayacentes PCM1 expresar núcleos de cardiomiocitos. C57 / BL10 a las 12 semanas de edad utilizado para los experimentos. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure2A.tif" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar complementa la figura 2A.</a> <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure2B.avi" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar complementa la figura 2B.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> componentes de la reacción </td><td colspan="2"> Número de reacciones </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 875 l </td><td> 2,19 ml </td></tr><tr><td> protector de cobre </td><td> 20 l </td><td> 50 l </td></tr><tr><td> colorante fluorescente picolilo azida </td><td> 5 l </td><td> 12,5 l </td></tr><tr><td> reacción diluidatampón preparado en 4.1 </td><td> 100 l </td><td> 250 l </td></tr><tr><td> volumen total de reacción </td><td> 1 ml </td><td> 2,5 ml </td></tr></tbody></table> Tabla 2: EDU ingredientes del cóctel. Receta para el cóctel de etiquetado EdU requerido por la Sección 4 del protocolo (Detección de EdU incorporación).

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Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Quantification of cardiomyocyte turnover is challenging. The protocol described here makes an important contribution to this challenge by enabling accurate and sensitive quantification of neo-cardiomyocyte nuclei generation and nuclei ploidy.

La evaluación simultánea de los cardiomiocitos de síntesis de ADN y la ploidía: Un Método de Ayuda a la cuantificación de los cardiomiocitos Regeneración y Facturación

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

simultaneous-assessment-cardiomyocyte-dna-synthesis-ploidy-method-to

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.3K vistas.  Newcastle University. Quantification of cardiomyocyte turnover is challenging. The protocol described here makes an important contribution to this challenge by enabling accurate and sensitive quantification of neo-cardiomyocyte nuclei generation and nuclei ploidy.

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Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data in all cells, including stem cells, and its integrity is fundamental to its regenerative ability. Stem cells undergo rapid propagation in labs to achieve the necessary numbers for transplantation. Accelerated cell growth leads to the loss of DNA integrity by accumulated metabolites, such as reactive oxygen, carbonyl, and alkylating agents. Transplanting these cells would result in poor engraftment and regeneration of the deteriorating organ. Moreover, transplanting DNA-damaged cells leads to mutations, DNA instability, cellular senescence, and possibly, life-threatening diseases such as cancer. Therefore, there is an immediate need for a quality control method to evaluate the cell's suitability for transplantation. Here, we provide step-by-step protocols for the assessment of the DNA integrity of stem cells prior to cell transplantation.

Here, we provide a detailed description of an experimental setup for an analysis of the assessment of DNA integrity in stem cells prior to cell transplantation.

Evaluar la integridad del ADN de la célula de vástago para terapia celular cardiaca

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data ...

Investigación

Genética

Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and cytokinesis) and acytokinetic mitosis (karyokinesis but no cytokinesis). Such atypical cell cycle variations result in polyploid and multinucleated cells rather than in cell division. Therefore, to determine cardiac turnover and regeneration, it is of crucial importance to correctly identify cardiomyocyte nuclei, the number of nuclei per cell, and their cell cycle status. This is especially true for the use of nuclear markers for identifying cell cycle activity, such as thymidine analogues Ki-67, PCNA, or pHH3. Here, we present methods for recognizing cardiomyocytes and their nuclearity and for determining their cell cycle activity. We use two published transgenic systems: the Myh6-H2B-mCh transgenic mouse line, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and the CAG-eGFP-anillin mouse line, for distinguishing cell division from cell cycle variations. Combined together, these two systems ease the study of cardiac regeneration and plasticity.

To distinguish cell division from cell cycle variations in cardiomyocytes, we present protocols using two transgenic mouse lines: Myh6-H2B-mCh transgenic mice, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and CAG-eGFP-anillin mice, for distinguishing cell division from cell cycle variations.

La visualización de las variaciones del ciclo celular y la determinación de la nucleación en cardiomiocitos postnatales

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and ...

Biología del Desarrollo

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events in cardiac myocytes such as proliferation and apoptosis require an accurate identification of cardiac myocyte nuclei to analyze cellular renewal in homeostasis and in pathological conditions2. Here, we provide a method to isolate cardiomyocyte nuclei from post mortem tissue by density sedimentation and immunolabeling with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) and subsequent flow cytometry sorting. This strategy allows a high throughput analysis and isolation with the advantage of working equally well on fresh tissue and frozen archival material. This makes it possible to study material already collected in biobanks. This technique is applicable and tested in a wide range of species and suitable for multiple downstream applications such as carbon-14 dating3, cell-cycle analysis4, visualization of thymidine analogues (e.g. BrdU and IdU)4, transcriptome and epigenetic analysis.

Cardiac nuclei are isolated via density sedimentation and immunolabeled with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) to identify and sort cardiomyocyte nuclei by flow cytometry.

El aislamiento de núcleos de cardiomiocitos a partir de tejidos post-mortem

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Medicina

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs). 
We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.

This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.

La evaluación de cardiomiocitos subtipos A raíz de reprogramación mediada por el factor de transcripción de fibroblastos embrionarios de ratón

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Assessing Cardiac Reprogramming using High Content Imaging Analysis

The goal of this protocol is to describe a method for quantifying induced cardiomyocyte-like cells (iCMs), which are directly reprogrammed in vitro by a reprogramming technique. Cardiac reprogramming provides a strategy to generate new cardiomyocytes. By introducing core cardiogenic transcription factors into fibroblasts; fibroblasts can be converted to iCMs without transition through the pluripotent stem cell state. However, the conversion rate of fibroblasts to iCMs still remains low. Accordingly, there have been numerous additional approaches to enhance cardiac reprogramming efficiency. Most of these studies assessed cardiac reprogramming efficiency using flow cytometry, while at the same time performed immunocytochemistry to visualize iCMs. Thus, at least two separate sets of reprogramming experiments are required to demonstrate the success of iCM reprogramming. In contrast, automated high content imaging analysis will provide both quantification and qualification of iCM reprogramming with a relatively small number of cells. With this method, it is possible to directly assess the quantity and quality of iCMs with a single reprogramming experiment. This approach will be able to facilitate future cardiac reprogramming studies that require large-scale reprogramming experiments such as screening genetic or pharmacological factors for enhancing reprogramming efficiency. In addition, the application of high content imaging analysis protocol is not limited to cardiac reprogramming. It can be applied to reprogramming of other cell lineages as well as any immunostaining experiments which need both quantification and visualization of immunostained cells.

We present a protocol to quantify directly reprogrammed induced cardiomyocyte-like cells (iCMs) in vitro using high content imaging analysis. This method allows us to quantify the efficiency of cardiac reprogramming in an automated manner and to directly visualize iCMs.

The goal of this protocol is to describe a method for quantifying induced cardiomyocyte-like cells (iCMs), which are directly reprogrammed in vitro by a ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

Perfiles de transcripción de los organismos unicelulares de los cardiomiocitos de ratón adulto

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Biología

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Análisis de la posición del ciclo celular en células de mamífero

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice

When the liver is injured, hepatocyte numbers decrease, while cell size, nuclear size and ploidy increase. The expansion of non-parenchymal cells such as cholangiocytes, myofibroblasts, progenitors and inflammatory cells also indicate chronic liver damage, tissue remodeling and disease progression. In this protocol, we describe a simple high-throughput approach for calculating changes in the cellular composition of the liver that are associated with injury, chronic disease and cancer. We show how information extracted from two-dimensional (2D) tissue sections can be used to quantify and calibrate hepatocyte nuclear ploidy within a sample and enable the user to locate specific ploidy subsets within the liver in situ. Our method requires access to fixed/frozen liver material, basic immunocytochemistry reagents and any standard high-content imaging platform. It serves as a powerful alternative to standard flow cytometry techniques, which require disruption of freshly collected tissue, loss of spatial information and potential disaggregation bias.

We present a robust, cost-effective, and flexible method for measuring changes in hepatocyte number and nuclear ploidy within fixed/cryopreserved tissue samples that does not require flow cytometry. Our approach provides a powerful sample-wide signature of liver cytology ideal for tracking the progression of liver injury and disease.

Un método in situ de alto rendimiento para la estimación de la ploideide nuclear de hepatocitos en ratones

When the liver is injured, hepatocyte numbers decrease, while cell size, nuclear size and ploidy increase. The expansion of non-parenchymal cells such as ...

Model of Ischemic Heart Disease and Video-Based Comparison of Cardiomyocyte Contraction Using hiPSC-Derived Cardiomyocytes

Ischemic heart disease is a significant cause of death worldwide. It has therefore been the subject of a tremendous amount of research, often with small-animal models such as rodents. However, the physiology of the human heart differs significantly from that of the rodent heart, underscoring the need for clinically relevant models to study heart disease. Here, we present a protocol to model ischemic heart disease using cardiomyocytes differentiated from human induced pluripotent stem cells (hiPS-CMs) and to quantify the damage and functional impairment of the ischemic cardiomyocytes. Exposure to 2% oxygen without glucose and serum increases the percentage of injured cells, which is indicated by staining of the nucleus with propidium iodide, and decreases cellular viability. These conditions also decrease the contractility of hiPS-CMs as confirmed by displacement vector field analysis of microscopic video images. This protocol may furthermore provide a convenient method for personalized drug screening by facilitating the use of hiPS cells from individual patients. Therefore, this model of ischemic heart disease, based on iPS-CMs of human origin, can provide a useful platform for drug screening and further research on ischemic heart disease.

We present a model of ischemic heart disease using cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells, together with a method for quantitative evaluation of tissue damage caused by ischemia. This model can provide a useful platform for drug screening and further research on ischemic heart disease.

Modelo de cardiopatía isquémica y comparación basada en vídeo de la contracción de cardiomiocitos utilizando cardiomiocitos derivados de hiPSC

Ischemic heart disease is a significant cause of death worldwide. It has therefore been the subject of a tremendous amount of research, often with ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

Aislamiento, cultivo y la transducción de cardiomiocitos de ratones adultos

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...