Name: isolation and ex vivo culture of vδ1+cd4+γδ t cells, an extrathymic αβt-cell progenitor
Uploaded: 2015-12-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Ex Vivo Culture of VÃŽÂ´1+CD4+ÃŽÂ³ÃŽÂ´ T Cells, an Extrathymic ÃŽÂ±ÃŽÂ²T-cell Progenitor at JoVE.com

Christian Welker is funded by a grant provided by the J&#252;rgen-Manchot-Stiftung.

Declaración de Ética: Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de Ética Clínica en la Universidad de Tubinga (proyecta 38 / 2009B02 y 470 / 2013B02). 1. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) <ol><li> Tome 50-100 ml de un voluntario sano a través de la punción venosa utilizando una jeringa de 50 ml que contiene 1.000 UI de heparina sulfato y diluir la sangre 1: 2 con PBS (pH = 7,2). </li><li> La capa cuidadosamente 35 ml de la sangre: solución de PBS en solución separando 15 ml de sangre tales como Biocoll (d = 1,077 g / ml) en un tubo cónico de 50 ml. Centrifugar durante 15 min a 800 xg a TA. NOTA: El freno no debe ser utilizado. </li><li> Recoger las células de la capa linfocítica con una pipeta y se lavan las células dos veces en por lo menos 50 ml de PBS (centrífuga de 12 min; a 400 xg). Eliminar el sobrenadante después de la centrifugación con una pipeta. </li><li> Lyse restante eritrocitos suspendiendo y incubAting la fracción linfocítica con 1-5 ml de una solución tampón hipotónico durante 2-4 min. NOTA: Duración de la exposición y el volumen de tampón de lisis depende del tampón de lisis utilizado y de la cantidad de glóbulos rojos que quedan en la fracción de linfocitos. </li><li> Diluir las células con PBS (01:10) y se centrifuga a 250 xg durante 12 min y, posteriormente, volver a suspender y se lava el sedimento celular una vez en 10 ml de PBS a 300 xg durante 12 min. </li><li> Resuspender los linfocitos en PBS y contar las células en una cámara de recuento Neubauer utilizando solución de azul de tripano. NOTA: Por lo general,&gt; 1 x 10 8 linfocitos se reciben de 100 ml recién extraída de la sangre periférica. </li></ol> 2. Aislamiento de células T Vδ1 <ol><li> Tome &lt;1 x 10 6 linfocitos aislados durante iniciales FACS que determinan la frecuencia de células T CD4 Vδ1. NOTA: Tamaño de la población de esta entidad de células T puede diferir mucho entre individuos y en función de su estado inmunológico. Typicaliado, aproximadamente 1% de las células T son Vδ1 + y aproximadamente 1-5% de las células son Vδ1 + CD4 +. <ol><li> Diluir las células con 1 ml de tampón FACS-, que consiste en PBS que contenía 2% de FCS y EDTA 5 mM. Centrifugar a 660 xg durante 2 minutos y decantar el sobrenadante. El volumen de reflujo de tampón FACS sobre 100 l es suficiente para la posterior tinción. Vórtice brevemente e incubar las células con 5 l de reactivo Fc-bloqueo durante 5 min a RT para aumentar la especificidad de la tinción FACS. </li><li> Añadir anticuerpos monoclonales humanos directamente a las células sin retirar el reactivo Fc-bloqueo. Asegúrese de teñir las células con anticuerpos contra Vδ1 (01:50), CD3 (01:50), CD4 (1: 200), CD8 (1: 200) y TCRαβ (1:25). Preparación del control isotipo con los isotipos de inmunoglobulinas correspondientes. Se incuban las células con anticuerpos durante 20 min a 4 ° C en la oscuridad. </li><li> Lavar las células en 1 ml de tampón FACS (Centrifugar durante 2 min; a 660 xg), se decanta el supernatant y proceder a la adquisición FACS en el volumen de tampón restante. </li></ol></li><li> Peletizar las células (que no se utilizan en el análisis FACS) por centrifugación durante 12 min; a 300 g; 8 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender el celular pelletin 60 l MACS-buffer por 1 x 10 7 células. Añadir 20 l de reactivo Fc-bloqueo por 1 x 10 7 células e incubar durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Añadir 10 l de anticuerpo anti-Vδ1 humana conjugado con FITC por 1 x 10 7 células directamente a las células. Incubar durante 12 min a 4 ° C en la oscuridad. </li><li> Lavar las células utilizando 14 ml MACS-buffer (centrifugar durante 12 min; a 300 g; 8 ° C). Desechar el sobrenadante y resuspender completamente las células en 80 l de tampón MACS por 1x10 7 células. </li><li> Tome 1-2 x 10 5 células y las diluir en tampón FACS 100 l para la verificación del etiquetado por análisis FACS. No se necesitan aditivos adicionales para este paso. Asegúrese de que no es un suficiente diferencia en el brillo para Vδ1 - y las células Vδ1 +. Si este no es el caso, repita los pasos 2.3) y 2.4). </li><li> Añadir 20 l microperlas anti-FITC por 1 x 10 7 células para las células restantes, mezclar bien e incubar durante 15 min en la oscuridad a 4 ° C. A partir de entonces, se lavan las células utilizando al menos 10 ml de tampón MACS (centrifugar durante 12 min, a 300 xg; 8 ° C). </li><li> Durante la centrifugación, equilibrar la columna magnética pre-enfriado colocado en un imán con tampón MACS 500 microlitros. </li><li> Resuspender las células en 500 l de tampón MACS-(para el número de células mayor que 1 x 10 8, ampliar este volumen en consecuencia) y aplicar cuidadosamente las células en la columna. Recoger el flujo a través que contiene el Vδ1 - células. </li><li> Lavar la columna tres veces con l MACS-buffer 500 y recoger el flujo a través de nuevo en el mismo tubo. Tenga en cuenta que el depósito debe estar vacío antes de aplicar tampón en la columna. </li><li> Retire la columna del dispositivo magnético y colocarlo en un tubo cónico de 15 ml. Vaciar rápidamente la columna con tampón MACS 1 ml empujando firmemente el émbolo en la columna. Recoger el eluido en un tubo. NOTA: Para obtener una pureza&gt; 98%, por lo general es necesario repetir los pasos 2,7 a 2,9) con una segunda columna. </li><li> Verificar la pureza de las células mediante análisis FACS 18 con el mismo panel de anticuerpos como antes (ver 2.1.2) y contar las células. </li></ol> 3. Aislamiento de células T + Vδ1CD4 <ol><li> Resuspender 25 l de cuentas de CD4 con un vórtice de&gt; 30 seg. Lavar las perlas (la cantidad mínima tal como se representa por el fabricante) en 1 ml de tampón MACS en un tubo de 1,5 ml de reacción colocando el tubo en un imán durante 1 min. Descartar el sobrenadante cuidadosamente con una pipeta a pequeña escala (200 l) y resuspender las perlas en el volumen original de tampón MACS-. </li><li> Granular Vδ1 + células (centrífuga de 12 minutos; a 300 xg) y aspirar el sobrenadante y resuspender todas las células + Vδ1 en 500 l de tampón MACS-y añadirlos al tubo que contenía las perlas. Mezclar vigorosamente y se incuba durante 20 min a 4 ° C con inclinación constante (por ejemplo, en un rotador). </li><li> Se coloca el tubo que contiene las células en un imán para 2 min. Asegúrese de que no hay restos en la tapa. NOTA: Las células CD4 + se han unido las perlas magnéticas y adjuntar a un lado del tubo frente al imán. </li><li> Abrir con cuidado la tapa mientras se mantiene el tubo en el interior del dispositivo magnético y recoger el sobrenadante que contiene el CD4 - células Vδ1 + usando una pipeta de pequeña escala. Coloque CD4 - las células Vδ1 + en un tubo separado y colocar este tubo en el imán de nuevo para evitar posiblemente restante células CD4 o perlas de la población. <ol><li> Lave el CD4 - las células en 5 ml MACS-buffer (centrifugar durante 12 min; a 300 xg) unnd resuspender en una concentración de 1 x 10 5 células por 100 medios de comunicación mu l. CD4 - las células pueden cultivarse fácilmente en las condiciones dadas a continuación (4.2). </li></ol></li><li> Coloque el tubo con los objetivos de células CD4 + fuera del campo magnético, resuspender las células en 500 l MACS-buffer y ponerlos de nuevo en el dispositivo magnético. Repetir los pasos 3.3 a 3.5 dos veces para obtener una mayor pureza. Aspirar el sobrenadante con la pipeta </li><li> Resuspender las células CD4 + en 100 l de medios de cultivo (RPMI 1640, 10% de FCS, 1% de L-glutamina, 1% de penicilina / estreptomicina) y añadir 10 l de una solución de perlas de desprendimiento. Incubar a TA durante 45 min con inclinación constante (por ejemplo, en un rotador). </li><li> Colocar las células en un imán para 1 min. Recoger cuidadosamente el sobrenadante que contiene células CD4 + + Vδ1-talón gratis con una pipeta de pequeña escala. </li><li> Fuera del imán, resuspender las perlas con medios de cultivo y 100 l de repeticiónpasos 3.6 y 3.7 dos veces para obtener el número de células más altos de células CD4 +. </li><li> Granular las células (centrifugar a 300 xg, durante 12 minutos) y descartar el sobrenadante por completo con la pipeta. Resuspender las células en los medios de comunicación, pre-calentado frescos y contarlos. Examinar la pureza de las células Vδ1 + + CD4 por análisis FACS representados en los pasos 2.1.1-2.1.3. </li></ol> Clonación 4.-célula individual por dilución limitada <ol><li> Aislar las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de un donante alogénico como se representa en 1/1 a 1/6. </li><li> Irradiar 2,5 x 10 7 PBMC alogénicas con 80 Gy en 25 ml de medio de cultivo utilizando γ-radiación. </li><li> Añadir IL-2 (200 U / ml), IL-7 (20 ng / ml) y PHA (2 mg / ml) a las células alimentadoras irradiadas y distribuirlos en placas de 96 pocillos en forma de U, 5 x 10 4 alimentador células en 50 l por pocillo. </li><li> Diluir las células Vδ1 + CD4 + a una concentración de 0,3 células por 50 l. Pipetate 50 l de la solución de células a cada pocillo que alberga las células irradiadas y citoquinas. NOTA: Por lo tanto, las citoquinas se diluyen a la concentración final de 100 U / ml de IL-2, 10 ng / ml de IL-7 y 1 mg / ml de PHA. Se incuban las placas de 96 pocillos en una incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2 humidificado atmósfera. <ol><li> Opcionalmente, cultivar restante purificado células Vδ1 + CD4 + como cultivo en masa en las mismas condiciones de cultivo como los clones. </li></ol></li><li> Suministrar las células cada 3-4 días con citoquinas y medio fresco. Para ello, el intercambio de la mitad del medio en los pocillos con 50 l de medio fresco mediante pipeteo. Añadir concentración 2 veces de citoquinas para cada suplementación. Añadir 5x10 4 células alimentadoras irradiados por pozo cada otra ronda de alimentación. </li><li> Usando un microscopio, observar primeros clones se hacen visibles después de 3-4 semanas, ya que metabolizan y por lo tanto cambiar el color de las colonias del medio de cultivo y la forma. NOTA: Para pielesTher cultivo, resuspender los clones bien y transferirlos para separar las placas de 96 pocillos. Analizar las células a través de FACS como se indica en 2.1.1-2.1.3. Los clones mantenidos en estas condiciones pueden llegar a cambiar su TCR de Vδ1 a αβTCR. El punto de tiempo para esto transdiferenciación varía de clon para clonar. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Para estudiar el fenotipo, la biología y la función de una entidad de células escasas (T-), es decir, las células T CD4 + + Vδ1, se utilizaron dos marcadores: Vδ1 y CD4 para su aislamiento celular magnética positiva. Vδ1 es un receptor huérfano, mientras que CD4 se expresa en células T helper, a un nivel inferior en monocitos y células dendríticas, y en un nivel muy bajo en las células progenitoras hematopoyéticas. Las técnicas para el enriquecimiento y la selección de células en alta pureza incluyen la fluorescencia de células (FACS), una técnica que separa una población de células en sub-poblaciones basadas en el marcaje fluorescente activado. Células teñidas utilizando anticuerpos conjugado con fluoróforo pueden separarse una de la otra dependiendo de qué fluoróforo (s) que han consolidado. Clasificadores pueden alcanzar la pureza cercana al 98% 19, lo cual es útil si la única necesidad es la clasificación en sí. Los inconvenientes de esta técnica son que las células ordenados muestran una disminución en vi celularcapacidad, y en nuestra población objetivo también un potencial reducido para transdifferention. A la viabilidad celular reducida después de la clasificación es la hipótesis de que se debe a las fuerzas de cizallamiento y estrés hidrodinámico que el FACS impone a las células. Por otra parte, para mantener las células viables y sin contaminación para la cultura posterior, el experimento debe llevarse a cabo en condiciones estériles asépticas que es difícil de manejar. Además, la separación FACS recomienda un alto número de células para la clasificación. Kits de aislamiento se han desarrollado a partir de varias empresas para el etiquetado magnético directa y la clasificación de células de acuerdo con múltiples marcadores de superficie. Su estrategia se basa en la eliminación de la etiqueta magnética de las células después de la primera especie mediante el uso de un reactivo de liberación, que elimina ya sea enzimáticamente o competitivamente la etiqueta magnética de la estructura a la que estaba destinado. Esto permite que un segundo etiquetado magnético y separación de las células para otro marcador de superficie de interés that se consigue mediante el uso de etiquetado, ya sea directo o indirecto con perlas magnéticas. La eliminación de la etiqueta recomienda trabajar a bajas temperaturas (en hielo, a 2-8 ° C) durante períodos prolongados de tiempo, la exposición a una sustancia química y etapas de lavado repetidas. Si las células diana de la segunda separación de parámetros están presentes en una concentración baja después de la selección (&lt;10% de células diana en la fracción positiva después de la primera separación) hasta una segunda ronda para la eliminación ofany células marcadas magnéticamente residual es necesario. Este procedimiento es además de tener una pérdida sustancial de las células diana, debido a los pasos de lavado-en repetidas alto riesgo para la inducción de daño celular y la pérdida de función debido a los factores estresantes mecánicos y fisiológicos. En comparación con FACS clasificación embargo preparaciones de células permanecen estériles y el número de células más pequeñas se pueden ordenar. La estrategia que buscamos combina dos selecciones positivas ejecutados consecutivamente, sin embargo, la retirada de la primera etiqueta no se requiere como el magnetic etiquetas difieren en la magnitud de sus fuerzas magnéticas por varias fases de registro. Mientras que la primera anti-fluorocromo magnéticamente marcado tipo de cordón es pequeño, con un diámetro de 50 nm, el segundo anti-fluorocromo magnéticamente marcado con medidas de tipo de cuentas de 1 a 4,5 m, superando así el volumen / fuerza de la primera etiqueta magnética 20 a 90 veces. Además, el segundo tipo positivo omite el estrés celular, que está asociado con la columna magnética de retención / liberación como células permanecen en un vial 1,5 ml que se pone en un dispositivo magnético de forma que las células marcadas se unen a la pared del vial. Los procedimientos de lavado se pueden mantener en una pequeña escala. Esta elaborado protocolo reduce la pérdida de células y aumenta la viabilidad celular ya que las células experimentan menos manipulación y pasan el proceso de aislamiento más rápido que los protocolos que utilizan sistemas de kit de aislamiento multisort. En consecuencia, este protocolo permite separar incluso un pequeño número de células y otra ventaja: células clasificadas permanecen steirritar a lo largo del procedimiento. Experimentos de clonación posteriores utilizando dilución limitante permite la expansión eficiente de los miembros individuales de las células aisladas, aquí la muy escasa Vδ1 + CD4 + T γδ entidad celular 18. Las células clasificadas muestran una excelente viabilidad y clonogenicidad y permanecen completamente funcional. Para futuras aplicaciones, utilizar esta estrategia para seleccionar cuantitativamente y purificar pequeñas entidades de células T de diversas fuentes humanas incluyendo sangre periférica recién extraída con éxito, (movilizados) productos leukapheresis, sangre del cordón umbilical y la médula ósea mediante la combinación de dos selecciones positivas realizadas consecutivamente usando etiquetas magnéticas que difieren por magnitud en sus fuerzas magnéticas y por lo tanto la capacidad de retención.

En los vertebrados, la inmunidad adaptativa que se estructura en el celular y una parte de la inmunidad humoral desempeña un papel importante en la defensa contra patógenos. El reconocimiento de una amplia gama de antígenos está mediada por T- hyperpolymorphic y receptores de células B (TCR / BCR), que con respecto a las células T se supone que se produce principalmente en el timo 1. A esto, las células madre hematopoyéticas (HSC), derivadas de la médula ósea, el timo semillas y diferenciar a lo largo de las etapas bien definidas, finalmente, que dan lugar a todos los linajes de células T. Thymus progenitores siembra son CD4 - y CD8 - y por lo tanto constituyen la fracción de timocitos inmaduros, doble negación (DN). Señales derivadas del timo entonces inducen su compromiso linaje y la diferenciación en cualquiera de las células T delta gamma o delta gamma. La expresión de genes funcionalmente reordenados cadena TCR-gamma y TCR-delta en DN2 / 3 timocitos conduce a gamma δTCR complejos, que impulsan una proliferación celulard promover la diferenciación en células DT γ 2,3. En contraste, el reordenamiento de una cadena TCR-β funcional, que puede emparejarse con preTα para construir un preTCR pT, induce el silenciamiento transcripcional de la cadena TCR-γ en timocitos DN3 y su transición a CD4 + CD8 + doble positivas timocitos 4 . En esta etapa, la recombinación de la cadena TCR-α se produce, eliminar el locus TCR-δ que está ubicado dentro del locus TCR-α, abrogando así la producción de un γδTCR en estas células irrevocablemente 5-9. ΑβTCRs reordenados se seleccionan posteriormente por su capacidad para unirse a la auto-MHC débilmente (selección positiva), que no podrá exceder de un cierto umbral para evitar la autoinmunidad (selección negativa). De acuerdo con su capacidad de unión a MHC de clase I o II, las células αβT seleccionados se convierten en células CD4 + de un solo positivo o T CD8 +, que salga el timo los linfocitos T como ingenuos. Sin embargo, la involución del timo comienza temprano en la vida que conduce a la producción de forma exponencial reducido de células T ingenuas que es casi extinguido después de la adolescencia 10. Sin embargo, el tamaño del grupo de células T permanece constante durante toda la vida, lo que se explica sólo en parte por la proliferación homeostática post-timo de las células T y la proliferación de larga vida memoria inmunológica 11. En consecuencia, debe ocurrir extrathymic desarrollo de las células T. Investigaciones recientes han ganado atractivo importante que caracterizó progenitores de células αβT, que -al extrathymic sitios dieron origen al delta gamma funcional células T 12-17. Sin embargo, un conocimiento detallado de extrathymic precursores de células αβT que independiente de un timo diferenciarse en células αβT es tan fragmentaria como el fondo que tenemos en la ruta que toman los mismos. Recientemente hemos identificado la pequeña entidad de células T de Vδ1 + </sup&gt; células CD4 + γδT como un extrathymic prognitor celular αβT 18, que cuando se aislaron de sangre periférica de donantes humanos sanos pueden transdiferenciarse en células αβT en un entorno inflamatoria leve. Curiosamente y contrario a la proliferación homeostática de las células T post-tímicos, transdiferenciación de las células Vδ1 CD4 + genera nuevos receptores de células T, ampliando así la diversidad repertorio, por lo que potencialmente nuevos antígenos pueden ser reconocidos y puede protección del huésped contra los patógenos recién adquiridas. Esto se suma a la plasticidad de las células T y añade una nueva vía hasta ahora no apreciado para extrathymic desarrollo de células T. El aislamiento cuantitativa de fuentes linfocítica, la generación de clones de células individuales y su expansión eficiente son esenciales para el objetivo de identificar a los marcadores y moléculas que desencadenan esta célula αβT precursor`s desarrollo extrathymic.

<table><tbody><tr><td>Biocoll Solution</td><td>Biochrom</td><td>L 6113</td><td>lymphocyte separating solution</td></tr><tr><td>Lysing Buffer</td><td>BD BioSciences</td><td>555899</td><td>lysis of erythrocytes&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MACS buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>supplement with BSA and pre-cool before use</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td>not mandatorily from this supplier</td></tr><tr><td>anti-human Vd1 FITC (clone:&amp;nbsp; TS8.2)</td><td>Thermo Scientific</td><td>TCR2730</td><td>not mandatorily from this supplier</td></tr><tr><td>anti-human CD3 PerCP (clone: SK7)</td><td>BD BioSciences</td><td>345766</td><td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td></tr><tr><td>anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31)</td><td>BD BioSciences</td><td>555548</td><td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td></tr><tr><td>anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466)&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-333</td><td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td></tr><tr><td>anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1)</td><td>BD BioSciences</td><td>641400</td><td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td></tr><tr><td>Anti-FITC MultiSort Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-058-701</td><td>yields better results than anti-FITC MicroBeads</td></tr><tr><td>MS columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td>pre-cool before use</td></tr><tr><td>MiniMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>CD4 Positive Isolation Kit</td><td>life technologies</td><td>11331D</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and ex vivo culture of v&#948;1+cd4+&#947;&#948; t cells, an extrathymic &#945;&#946;t-cell progenitor

El timo, el órgano principal para la generación de células T delta gamma y columna vertebral del sistema inmune adaptativo en los vertebrados, ha sido considerado como la única fuente de células αβT. Sin embargo, la involución del timo comienza temprano en la vida que conduce a una reducción de la producción de manera drástica de las células αβT ingenuos en la periferia. Sin embargo, incluso los centenarios pueden crear inmunidad contra patógenos recién adquiridas. Investigaciones recientes sugieren el desarrollo de células αβT extrathymic, sin embargo, nuestra comprensión de las vías que pueden compensar la pérdida de la función del timo son todavía rudimentario. células γδ T son linfocitos innatas que constituyen la principal subconjunto de células T en los tejidos. Recientemente nos atribuimos una función destacada hasta ahora poco apreciado a un γδ T subconjunto de células al mostrar que la entidad escasa de células CD4 + Vδ1 + γδ células T pueden transdiferenciarse en células αβT en condiciones inflamatorias. En este sentido, provide el protocolo para el aislamiento de este progenitoras de la sangre periférica y su cultivo posterior. Vδ1 células se enriquecen positivamente a partir de PBMCs de donantes humanos sanos, utilizando perlas magnéticas, seguido de una segunda etapa en la que nos dirigimos a la escasa fracción de células CD4 + con una técnica de etiquetado magnético más. La fuerza magnética del segundo etiquetado excede el de la primera etiqueta magnética, y por lo tanto permite el aislamiento positivo eficiente, cuantitativa y específica de la población de interés. Se introduce entonces la condición técnica y la cultura requerida para la clonación y eficientemente la expansión de las células y para la identificación de los clones generados por análisis FACS. Por lo tanto, ofrecemos un protocolo detallado para la purificación, la cultura y la expansión ex vivo de delta gamma células T CD4 + Vδ1 +. Este conocimiento es requisito indispensable para los estudios que se relacionan con este αβT progenitor`s celulares biología y para aquellos que pretenden identify los desencadenantes moleculares que intervienen en su transdiferenciación.

La Figura 1 representa las diferentes etapas y el resultado del aislamiento de células T Vδ1 partir de sangre periférica. La Figura 1A muestra una distribución típica de las células Vδ1 + en los linfocitos CD3 +, así como la expresión co-receptor de la población Vδ1 +. En este donante, la frecuencia de Vδ1 + células (rojo) es 2,3% de total de linfocitos y la expresión de CD4 (verde) de Vδ1 + linfocitos es 2,6%. En total, la población objetivo para el aislamiento representa 0,06% de linfocitos totales en este donante. Figura 1B muestra una intensidad de tinción óptimo para las células Vδ1 + antes de proceder al etiquetado magnético. La tinción con el anticuerpo primario debe dar lugar a distintas poblaciones positivas claramente negativos y Vδ1 Vδ1 modo que las células Vδ1 + eficientemente pueden ser etiquetados y separados con el magnperlas etic. La Figura 1C representa las células Vδ1 + después del procedimiento de aislamiento por análisis FACS. La pureza de Vδ1 + suele ser&gt; 99% de células CD3 +. Para aumentar la pureza, las células aisladas se aplican sobre una segunda columna de aislamiento. Este resultado en una considerable pérdida de células sin embargo esto pasos conduce a la eliminación cuantitativa de células potencialmente contaminantes TCRαβ + CD4 +. Los resultados de la CD4 + aislamiento se muestran en la Figura 2. Debido a los bajos números de CD4 + Vδ1 + células, y ya que las células se expanden en una sola célula de dilución limitada clonación enfoque pureza de las células CD4 + de menos de 100% puede será tolerado. En el experimento mostrado aquí, la pureza de las células Vδ1 + CD4 + fue aproximadamente el 90% (Figura 2A, blot derecha) y posterior clonación de una sola célula como resultado más de 60 Vδ1+ Clones de células T CD4 +. Por el contrario, en el Vδ1 + CD4 - fracción no las células CD4 + se mantuvieron (Figura 2B), que pone de relieve la eficacia de esta estrategia de aislamiento. Es de destacar que las células CD4 + (Azules) expresan Vδ1 a un nivel inferior distinguibles de CD4 - las células (rojo) (Figura 2A, ambas transferencias). Por lo tanto, la tinción de las células Vδ1 + debe ser excesiva como se describe en el protocolo para un etiquetado adecuado y el aislamiento con éxito de la fracción CD4 + dentro de la piscina de células T Vδ1 +. En la Figura 3A, se presenta el fenotipo típico de un clon emergente. El TCR se compone de un Vδ1 y una cadena Vγ9 y las células clonales expresan CD3 y CD4. Figura 3B representa el proceso de transdiferenciación de un clon aislado con la técnica presentada. Transdiferenciación incluye los downregulatiel del V&#39;1 de cadena a un bajo nivel de expresión, que es paralela a la expresión de novo de un αβTCR. Esto conduce a un fenotipo de TCR de doble positiva transitoria que finalmente da lugar a células T que expresan αβTCR de un solo positivos. La expresión co-receptor también puede cambiar durante el curso de la transdiferenciación. Al igual que en los timocitos, se puede producir un fenotipo CD4 + CD8 + DP, que finalmente se convierte en cualquiera de las células CD8 + T αβ CD4 + o SP. Bajo las condiciones de cultivo que aquí se presentan, transdiferenciación es de sólo un raro evento uno de cada 50 clones cambiado su Vδ1 + TCR en αβTCR. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53482/53482fig1.jpg" /> Figura 1. FACS análisis de seguimiento de todas las etapas del proceso de aislamiento de células T V δ1 a partir de sangre periférica. (A &lt;/ strong&gt;) Distribución de Vδ1 + células (rojo) en las células CD3 + de linfocitos de sangre periférica y su expresión co-receptor. Células CD4 + Vδ1 + se indican en azul (círculo). (B) Tinción de la fracción Vδ1 antes de proceder al etiquetado magnético. (C) FACS análisis de Vδ1 + células de la fracción positiva después de aislamiento. Los números indican el porcentaje de células cerradas. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53482/53482fig1large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53482/53482fig2.jpg" /> Figura 2. FACS análisis de V δ 1 CD4 + aislados de (A) + CD4 fracción y (B) CD4 -. Fraccióndespués de aislamiento de células CD4 +. Los números indican el porcentaje de células cerradas. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53482/53482fig2large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/53482/53482fig3.jpg" /> Figura 3. Análisis fenotípico de un clon de la derecha después de la detección. (A) composición de TCR y co-receptor expresión de un clon recién aisladas. Vδ1 y Vγ9 TCR se co-expresan con CD3 y CD4. (B) Proceso de transdiferenciación en un clon de células CD4 + Vδ1 +. Cambio de expresión TCR (arriba), y el cambio de la expresión de co-receptor (abajo) 18. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53482/53482fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Aislamiento y<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura de Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; Las células γδ T, una célula αβT Progenitor Extrathymic

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

isolation-ex-vivo-culture-v1-cd4-t-cells-an-extrathymic-t-cell

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

9.2K vistas.  Children's University Hospital Tübingen. Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral Vδ1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic αβ T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Video: Isolation and Ex Vivo Culture of Vδ1+CD4+γδ T Cells, an Extrathymic αβT-cell Progenitor

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T cell replacement in lymphopenic patients. We studied thymic settling progenitors from murine embryonic day 13 and 18 thymi by two complementary in vitro and in vivo techniques, both based on the &#8220;hanging drop&#8221; method. This method allowed colonizing irradiated fetal thymic lobes with E13 and/or E18 thymic progenitors distinguished by CD45 allotypic markers and thus following their progeny. Colonization with mixed populations allows analyzing cell autonomous differences in biologic properties of the progenitors while colonization with either population removes possible competitive selective pressures. The colonized thymic lobes can also be grafted in immunodeficient male recipient mice allowing the analysis of the mature T cell progeny in vivo, such as population dynamics of the peripheral immune system and colonization of different tissues and organs. Fetal thymic organ cultures revealed that E13 progenitors developed rapidly into all mature CD3+ cells and gave rise to the canonical &#947;&#948; T cell subset, known as dendritic epithelial T cells. In comparison, E18 progenitors have a delayed differentiation and were unable to generate dendritic epithelial T cells. The monitoring of peripheral blood of thymus-grafted CD3-/- mice further showed that E18 thymic settling progenitors generate, with time, larger numbers of mature T cells than their E13 counterparts, a feature that could not be appreciated in the short term fetal thymic organ cultures.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

Caracterización de tímico Instalarse Progenitores en el embrión de ratón Uso<em&gt; En Vivo</em&gt; Y<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensayos

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully generated and infused T-cells specific for Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) and Adenovirus (Adv) using monocytes and EBV-transformed lymphoblastoid cell (EBV-LCL) gene-modified with an adenovirus vector as antigen presenting cells (APCs). As few as 2x105/kg trivirus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) proliferated by several logs after infusion and appeared to prevent and treat even severe viral disease resistant to other available therapies. The broader implementation of this encouraging approach is limited by high production costs, complexity of manufacture and the prolonged time (4-6 weeks for EBV-LCL generation, and 4-8 weeks for CTL manufacture &#x2013; total 10-14 weeks) for preparation. To overcome these limitations we have developed a new, GMP-compliant CTL production protocol. First, in place of adenovectors to stimulate T-cells we use dendritic cells (DCs) nucleofected with DNA plasmids encoding LMP2, EBNA1 and BZLF1 (EBV), Hexon and Penton (Adv), and pp65 and IE1 (CMV) as antigen-presenting cells. These APCs reactivate T cells specific for all the stimulating antigens. Second, culture of activated T-cells in the presence of IL-4 (1,000U/ml) and IL-7 (10ng/ml) increases and sustains the repertoire and frequency of specific T cells in our lines. Third, we have used a new, gas permeable culture device (G-Rex) that promotes the expansion and survival of large cell numbers after a single stimulation, thus removing the requirement for EBV-LCLs and reducing technician intervention. By implementing these changes we can now produce multispecific CTL targeting EBV, CMV, and Adv at a cost per 106 cells that is reduced by &gt;90%, and in just 10 days rather than 10 weeks using an approach that may be extended to additional protective viral antigens. Our FDA-approved approach should be of value for prophylactic and treatment applications for high risk allogeneic HSCT recipients.

A rapid, simple and cost-effective protocol for the generation of donor-derived multivirus-specific CTLs (rCTL) for infusion to allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients at risk of developing CMV, Adv or EBV infections. This manufacturing process is GMP-compliant and should ensure the broader implementation of T-cell immunotherapy beyond specialized centers.

Generación de células T Multivirus específicos para prevenir / tratar las infecciones virales después de trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Inmunología e Infección

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

Aislamiento y diferenciación de Th17 Naïve linfocitos T CD4

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major histocompatibility complex (MHC)-independent manner and develop strong cytolytic effector function that makes it an ideal candidate for cancer immunotherapy. Due to the low frequency of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T cells in the peripheral blood, we developed an effective protocol to greatly expand a highly pure &#947;&#948; T cells drug product for first-in-human use of allogeneic &#947;&#948; T cells in patients with acute myeloid leukemia (AML). Using healthy donor apheresis as an allogenic cell source, the lymphocytes are isolated using a validated device for a counterflow centrifugation method of separating cells by size and density. 
The lymphocyte-rich fraction is utilized, and the &#947;&#948; T cells are preferentially activated with zoledronic acid (FDA-approved) and interleukin (IL)-2 for 7 days. Following the preferential expansion of &#947;&#948; T cells, a clinical-grade magnetic cell-separation device and TCR&#945;&#946; beads are used to deplete contaminating T-cell receptor (TCR)&#945;&#946; T cells. The highly enriched &#947;&#948; T cells then undergo a second expansion using engineered artificial antigen-presenting cells (aAPCs) derived from K562 cells-genetically engineered to express single-chain variable fragment (scFv) for CD3 and CD28, 41BBL (CD137L) and IL15-RA-together with zoledronic acid and IL-2. Seeding all day-7 enriched &#947;&#948; T cells in co-culture with the aAPCs facilitates the manufacture of highly pure &#947;&#948; T cells with an average fold expansion of &gt;229,000-fold from healthy donor blood.

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta &#947;&#948; T Cells from Apheresed Human Product

Presented is a protocol for the expansion of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T cell drug product. Lymphocytes are isolated by elutriation and &#947;&#948;-enriched with zoledronic acid and interleukin-2. Alpha-beta T cells are depleted using a clinical-grade magnetic separation device. The &#947;&#948; cells are co-cultured with K562-derived, artificial antigen-presenting cells and expanded.

Expansión y enriquecimiento de células T gamma-delta (γδ) a partir de productos humanos aféridos

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

Investigación sobre el cáncer

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Ratón Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Aislamiento de células T y<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciación en subconjuntos de células T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have been conducive to downstream in vivo functional analysis of TCR heterodimers. We have developed an improved protocol based on a two-step multiplex-nested PCR, which results in a PCR product that spans entire variable regions of a human TCR alpha and beta chains. By identifying unique restriction sites and incorporating them into the PCR primers, we have made the PCR product compatible with direct sub-cloning into the template retroviral vector. The resulting retroviral construct encodes a chimeric human/mouse TCR with a mouse intracellular domain, which is functional in mouse cells or in in vivo mouse models. Overall, the protocol described here combines human single cell paired TCR alpha and beta chain identification with streamlined generation of retroviral vectors readily adaptable for in vitro and in vivo TCR expression. The video and the accompanying material are designed to give a highly detailed description of the single cell PCR, so that the critical steps can be followed and potential pitfalls avoided. Additionally, we provide a detailed description of the cloning steps necessary to generate the expression vector. Once mastered, the whole procedure from single cell sorting to TCR expression could be performed in a short two-week period.

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

The current protocol combines single cell paired human TCR alpha and beta chain sequencing with streamlined generation of retroviral vectors compatible with in vitro and in vivo TCR expression.

Aerodinámico unicelular TCR aislamiento y generación de vectores retrovirales para In Vitro y In Vivo expresión de TCR humana

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have ...

Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high mortality, despite new therapeutic options such as transcatheter aortic valve replacement (TAVR). 
The complete pathways that start with valve calcification and lead to severe aortic stenosis remain only partly understood. By providing a close representation of the aortic valve cells in vivo, the assaying of T lymphocytes from stenotic valve tissue could be an efficient way to clarify their role in the development of calcification. After surgical excision, the fresh aortic valve sample is dissected in small pieces and the T lymphocytes are cultured, cloned then analyzed using fluorescence activated cell sorting (FACS).
The staining procedure is simple and the stained tubes can also be fixed using 0.5% of paraformaldehyde and analyzed up to 15 days later. The results generated from the staining panel can be used to track changes in T cell concentrations over time in relation to intervention and could easily be further developed to assess activation states of specific T cell subtypes of interest. In this study, we show the isolation of T cells, performed on fresh calcified aortic valve samples and the steps of analyzing T cell clones using flow cytometry to further understand the role of adaptive immunity in CAVD pathophysiology.

In this study, we describe the process of T lymphocyte isolation from fresh samples of calcified aortic valves and the analytical steps of T cell-cloning for the characterization of the adaptive leukocyte subsets by using flow cytometry analysis.

Investigación de la calcificación de la válvula aórtica a través del aislamiento y cultivo de linfocitos T utilizando células alimentadoras de la capa de Buffy irradiada

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high ...

<meta charset="utf8"></head><body>Técnica de imagen de alta resolución para la detección de microdominiosCa-2+ en células T

Imaging Initial Ca2+ Microdomains in Primary T Cells

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and might already determine the fate of a T cell. Upon T cell receptor activation, NAADP is formed rapidly, binding to NAADP binding proteins (HN1L/JPT2, LSM12) and their respective receptors (RyR1, TPC2) sitting on intracellular Ca2+ stores, like the ER and lysosomes, and leading to subsequent release and elevation of [Ca2+]i. To capture these fast and dynamically occurring Ca2+ signals, we developed a high-resolution imaging technique using a combination of two Ca2+ indicators, Fluo-4 AM and FuraRed AM. For postprocessing, an open-source, semi-automated Ca2+ microdomain detection approach was developed based on the programming language Python. Using this workflow, we are able to reliably detect Ca2+ microdomains on a subcellular level in primary murine and human T cells in high temporal and spatial resolution fluorescence videos. This method can also be applied to other cell types, like NK cells and murine neuronal cell lines.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: Desentrañando la activación inicial de la respuesta inmunitaria adaptativa para la intervención terapéutica

Here, we provide a comprehensive protocol to resolve initial local Ca2+ signals, known as Ca2+ microdomains, in primary murine and human T cells using fluorescence microscopy. This protocol serves as a valuable resource for researchers examining Ca2+ signaling pathways within immune cells and to further unravel their function.

Obtención de imágenes de microdominios Ca2+ iniciales en células T primarias

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Obtención de imágenes de microdominios Ca²⁺ iniciales en células T primarias

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