This work was supported in part by the US National Institutes of Health (R01 HL 111600) and the American Heart Association (12SDG9010015).

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California, Davis, y se adhirieron a la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio publicado por los Institutos Nacionales de Salud. 1. Preparación <ol><li> Prepare dos concentrados (25X) los stocks de solución de Tyrode modificada por adelantado y se almacena a 4 ° C: (1) de la I (en mM: NaCl 3205, CaCl2 32,5, KCl 117.5, NaH 2 PO 4 29.75, MgCl2 26.25) y (2) de la II (en mM: NaHCO3 500). <ol><li> Recién preparar la solución de 2 L Tyrode de la siguiente composición (en mM): NaCl 128,2, CaCl 2 1,3, KCl 4,7, MgCl 2 1,05, NaH 2 PO 4 1,19, NaHCO3 20 y glucosa 11,1 mediante la combinación de 1840 ml de agua desionizada (DI) agua, 80 ml Stock I, 80 ml de Stock II, y 4 g de glucosa. No mezclar directamente de la I y II de la; añadir elm a 1840 ml DI para evitar la precipitación. </li></ol></li><li> Preparar la solución madre del desacoplador blebbistatin excitación-contracción en 10 mg / ml en anhidro di-metilsulfóxido (DMSO) con antelación y almacenar la solución madre a 4 ° C. </li><li> Preparar soluciones madre de colorantes fluorescentes: (1) RH237 sensibles al voltaje colorante (1 mg / ml en DMSO) y (2) indicador de calcio de baja afinidad Fluo-5N AM (2 mg / ml en DMSO) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Utilice los preparativos de inmediato para evitar la descomposición, con la consiguiente pérdida de capacidad de carga. </li><li> Cebe la recirculación sistema de perfusión Langendorff con oxigenada (95% O 2, 2 5% de CO) solución de Tyrode. Ajustar el flujo de O 2 / CO 2 para mantener el pH de la solución de Tyrode a 7,4 ± 0,05. Utilice un filtro de red en línea de nylon tejido (tamaño de poro: 11 micras) para filtrar continuamente el líquido de perfusión. <ol><li> Cebe el sistema de perfusión a temperatura ambiente, como la posterior loading de Fluo-5N AM se lleva a cabo a temperatura ambiente. Para Fluo-5N AM carga, utilice un pequeño volumen de líquido de perfusión de recirculación (~ 150 ml). Después de colorante de carga, utilizar un volumen mayor de líquido de perfusión (1 - 2 L, véase la Figura 1C). </li></ol></li><li> Encienda el sistema de adquisición de datos y prepararse para la monitorización continua de la presión de ECG y la perfusión. Prepara sistema de presión-vigilancia: Conecte un transductor de presión a la línea de perfusión y monitorear la presión de perfusión con un amplificador transbridge. Ajuste la presión de perfusión basal a 0 mmHg cuando el corazón no está conectado al sistema de perfusión. </li><li> Alinear las cámaras de mapeo óptico para asegurar la alineación espacial entre el V my SR Ca 2 + señales. <ol><li> En primer lugar, se centran las cámaras mediante la colocación de un gobernante o un objeto con el texto en el plato de la perfusión. A su vez las cámaras de mapeo en un modo de visualización en directo y ajustar el enfoque hasta que el texto es nítido y claro. Adquirir una sola imagen Marco de cada cámara. </li><li> Superposiciónestas imágenes y ajustar la transparencia de la imagen de arriba, así que ambas imágenes son visibles. El texto en las imágenes debe superponerse con exactitud. Si no perfectamente alineados, ajustar el ángulo del espejo dicroico o la posición de cada cámara hasta que se alinean las dos imágenes. </li></ol></li></ol> 2. La recolección, perfusión y tinte de carga del corazón de conejo <ol><li> Asegure el conejo en un retenedor de conejo aprobado. Profundamente anestesiar a través de una inyección intravenosa (vena marginal de la oreja) de pentobarbital sódico (50 mg / kg) y heparina (1000 IU). <ol><li> Cuando los conejos pantallas carecen de reflejos nociceptivos, hacer una incisión en la piel en la línea media para exponer el esternón y las costillas. Corte a través del esternón con-contundentes punta tijeras quirúrgicas desde el xifoides al manubrio. Tenga cuidado de no dañar el corazón al abrir el esternón. Difundir las costillas para exponer el corazón. </li><li> Extirpar rápidamente todo el bloque corazón-pulmón cortando rápidamente todos los vasos y tejido conectivo. Immediatamente colocar el bloque corazón-pulmón en solución enfriada con hielo de Tyrode. </li></ol></li><li> Localice la aorta para la perfusión retrógrada. Cortar la aorta ascendente proximal a las tres ramas del cayado aórtico. Canular la aorta a una cánula de 8 G conectado al sistema de perfusión. Use un pedazo de sutura USP 0 seda para asegurar la aorta en la cánula. </li><li> Diseccionar cuidadosamente la tráquea, los pulmones y la grasa epicárdica del corazón. Con un fuerte pinzas y tijeras de disección, localizar la válvula mitral y cuidadosamente dañar o quitar un folleto para evitar la congestión de la solución en el ventrículo izquierdo. </li><li> Sumergir el corazón en la cámara de perfusión con camisa de vidrio horizontalmente con la superficie anterior del corazón hacia arriba para formación de imágenes. Fije la cánula a una pieza de Sylgard con los pernos en forma de U en la parte inferior del plato de silicio para evitar el movimiento del corazón durante el mapeo (Figura 1D). Si lo desea, inserte un alfiler pequeño insecto en el ápice del corazón por stabilización. </li><li> Posición electrocardiograma (ECG) electrodos en el baño en el lado derecho e izquierdo del corazón. Sumergir totalmente los electrodos en el baño y asegurarse de que no están en contacto con la superficie del corazón para proporcionar un ECG volumen realizado análoga a una configuración de derivación I. Verifique un plomo normal, me ECG morfología. Ajuste el flujo (25 - 35 ml / min) para asegurar que la presión aórtica se mantiene a 60 - 70 mmHg. </li><li> Apague las luces de la sala y añadir 0,3 a 0,6 ml de solución madre blebbistatin (paso 1.2) a la perfusión (concentración final 10 a 20 M). <ol><li> Apague las luces de las habitaciones para evitar fotoinactivación de blebbistatin. Si es necesario, un pequeño proyector o faro se pueden usar para proporcionar iluminación de la tarea. Nota: blebbistatin es un inhibidor de la ATPasa de la miosina y un desacoplador excitación-contracción. Debido Fluo-5N carga requiere condiciones prolongados (60 min) RT (hipotermia) (consulte los pasos 2,8 - 2,10), la producción de energía cardiaca podría estar comprometida. Therefore, la adición de blebbistatin en el perfundido antes de colorante de carga puede reducir la demanda de energía 16 y eliminar los artefactos de movimiento durante las grabaciones ópticas posteriores 17. </li></ol></li><li> Cuando la contracción del corazón ha cesado (10 - 15 min, verificado en el registro de la presión aórtica), cambiar al sistema de perfusión de recirculación de pequeño volumen (vea el paso 1.4.1). </li><li> Preparar y cargar solución de carga Fluo-5N AM: Añadir 0,25 ml de Fluo-5N AM solución madre (paso 1.3) a 0,25 ml cálida 20% F127 Pluronic. Añadir 0,5 ml de solución caliente de Tyrode a la mezcla, mezclar bien y agregar al sistema de perfusión de recirculación de pequeño volumen. </li><li> Monitorear continuamente la presión de perfusión y ECG y ajustar el flujo si es necesario. Colorante de carga dura aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente. 45 min después de la carga ha comenzado, encienda el baño de agua circulante para comenzar a calentar el sistema de perfusión y la perfusión a 37 ° C. </li><li> Después de 60 minutos de Fluo-5N AM carga, switch la perfusión para el sistema de perfusión recirculante volumen más grande (véase el paso 1.4). </li><li> Diluir 50 l de solución de colorante sensible al voltaje de la RH237 (etapa 1.3) en 1 ml de solución caliente de Tyrode y se añade lentamente (más de ~ 5 min) en un puerto de inyección proximal a la cánula. </li></ol> 3. Mapeo óptico <ol><li> Durante los momentos finales de colorante de carga, coloque el corazón y el enfoque de las cámaras de mapeo óptico para asegurar el campo apropiado de vista para el experimento. </li><li> Si lo desea, coloque un electrodo de estimulación bipolar en la superficie epicárdica del corazón para la estimulación. </li><li> Coloque un plástico o de vidrio cubierta de resbalón en la superficie de la cámara de perfusión para reducir los artefactos de movimiento en la superficie del líquido que puede estar presente debido a la recirculación del líquido de perfusión. Nota: Como alternativa a una hoja de cubierta, utilice una cubierta de plástico de cocina limpio 50 mm Petri. </li><li> Centrarse las guías de luz para iluminar uniformemente la superficie del corazón con el correoluz xcitation. Utilice azul diodo emisor de luz (LED) fuentes de luz y filtrar aún más la luz con un 475 a 495 nm filtro de banda (Figura 1). </li><li> Recoger fluorescencia emitida con un macroscopio y dos de metal-óxido-semiconductor (CMOS) cámaras de mapeo óptico complementarias. Dividir la luz emitida con un espejo dicroico a 545 nm. <ol><li> -Pass largo filtrar la fracción de longitud de onda más larga, que contiene la señal m V, a 700 nm. De paso de banda filtrar la fracción de longitud de onda más corta, que contiene la señal SR Ca 2 +, 502 a 534 nm (Figura 1A). Ajuste la frecuencia de adquisición de datos ópticos de 0,5 a 1 kHz. </li></ol></li><li> Para cada grabación óptica, primero iniciar el protocolo de estimulación deseada, encender la luz de excitación, y recoger 1-4 seg de datos. Si lo desea, sincronizar el protocolos de estimulación y adquisición de datos. Nota: No es posible volver a cargar el Fluo-5N AM, por lo tanto la relación señal a ruido (SNR) se decreaSE lo largo del experimento debido a teñir fuga de la SR. Limite protocolo experimental a 1 - 2 horas para asegurar altos valores de SNR. </li><li> Tras el experimento, lavar el sistema de perfusión en la secuencia de agua DI, 70% de alcohol reactivo, y nuevamente con agua DI. </li><li> Filtra cada conjunto de datos con un filtro gaussiano espacial (radio de 3 píxeles) utilizando paquetes de software disponibles comercialmente de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li><li> Si es necesario, espacialmente alinear el V my SR conjuntos de datos Ca 2+. Como en el paso 1.6, superponer imágenes de cada cámara y verificar que las estructuras anatómicas del corazón (es decir., Vasculatura coronaria, bordes de las aurículas o ventrículos) u otros artículos en el campo de visión (es decir, la cánula, el electrodo de estimulación) exactamente solapamiento. Si no, la alineación espacial de los conjuntos de datos es necesario. </li><li> Cambie la imagen transparente superior se logra en las direcciones x e y-dirección hasta que la superposición exacta, tomando nota del número de píxelesla imagen debe ser desplazado en cada dirección. Todo el conjunto de datos correspondiente a la parte superior de la imagen (ya sea V m o SR Ca 2+) debe entonces ser desplazado por el número determinado de píxeles en cada dirección para asegurar la alineación precisa entre el V y m SR Ca 2+ conjuntos de datos. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Las claves del éxito Fluo-5N colorante de carga son la configuración de perfusión de recirculación de pequeño volumen, lo que permite una alta concentración Fluo-5N sin la necesidad de grandes cantidades de colorante, la longitud de tiempo de carga (1 hr), y la realización de la carga a TA. Si la carga se realiza a temperaturas fisiológicas, la actividad enzimática celular rápidamente escinde la etiqueta -AM cuando el colorante atraviesa la membrana celular, atrapando las moléculas de colorante en el citosol y no lo que les permite cruzar la membrana SR. A RT, sin embargo, la actividad enzimática se hace más lenta y una cantidad suficiente de colorante puede cruzar tanto la membrana celular y la membrana SR antes de la etiqueta -AM se escinde, atrapando el colorante en la SR. Incluso con las condiciones de carga óptimas, sin embargo, las amplitudes de señal y cambios de fluorescencia fraccionarios (Df / F) con este enfoque serán menores que con la cartografía tradicional óptica de V my Ca2 + intracelular con tintes de alta afinidad. Por ejemplo, con la configuración óptica usada aquí, que consiste en la luz LED de excitación, objetivos macroscópicas, filtros grandes y el espejo dicroico (5 cm x 5 cm), y cámaras CMOS, cambios de fluorescencia fraccionarios (Df / F) son del orden de 1 - 2% para la señal de Fluo-5N y 2 - 3% para la señal RH237 15. La fluorescencia fraccionada será, por supuesto, depende de la configuración específica óptica, fuente de luz, y las cámaras de una configuración particular, pero incluso en condiciones óptimas la señal de Fluo-5N es significativamente menor que lo que se observa típicamente para las grabaciones de Ca2 + intracelular con tintes de alta afinidad. Por ejemplo, en la misma instalación, Df / F es del orden de 20 - 30% para Rhod-2 cuando está verde (545 ​​nm) de luz de excitación se utiliza 18. La luz de excitación verde es también más cerca del pico de excitación de RH237, así el Delta F / F de RH237 también es mayor en este caso, alrededor del 4 - 5%. Por lo tanto, para los laboratorios ya la realización de la cartografía óptica dual de V m </sub&gt; y Ca2 + intracelular, se debe tener cuidado para optimizar todos los componentes de la configuración óptica para garantizar la máxima Df / F para la señal de Fluo-5N. Con este enfoque, los investigadores pueden investigar precisamente SR Ca 2+ dinámica y su impacto en V m en formas que no son posibles con los enfoques existentes. Por ejemplo, las mediciones cuantitativas de la SR Ca2 + de fugas (como en la figura 3A) y la constante de tiempo preciso de SR 2+ recuperación Ca (medida -a tau de SR 2+ -ATPasa [SERCA] actividad Ca) se pueden realizar. El uso de los enfoques existentes para el mapeo óptico del Ca2 + intracelular con tintes de alta afinidad, estas medidas pueden ser &quot;contaminados&quot; con transmembrana de Ca2 + flujo (es decir., Contribuciones de tipo L de Ca 2 + canales y el Na + -ca 2 + intercambiador). Por otra parte, de alta afinidad Ca 2+ indicadores tienen k inherentemente más lentapor lo tanto se espera que los indicadores inetics baja afinidad 5, señales Fluo-5N para informar sobre precisos SR Ca 2+ movimientos con alta fidelidad y esencialmente ningún retardo de tiempo entre los cambios reales Ca 2+ y los cambios correspondientes en la fluorescencia. La capacidad para investigar los mecanismos detallados por el cual SR Ca 2 + liberación y recaptación contribuyen a fenómenos arritmogénica es otra ventaja de este enfoque. Por ejemplo, el uso de esta metodología, recientemente informó de cómo la refractariedad de la SR Ca 2 + liberación contribuye a la aparición de Ca 2+ alternancia y que durante la fibrilación ventricular, SR Ca 2 + liberación permanece casi continuamente refractaria 15. Este fue el primer informe de la SR Ca2 + dinámica durante la fibrilación y pone de relieve la ventaja clave de las imágenes SR Ca2 + en el corazón intacto: fenómenos espacialmente distintas y complejas como la alternancia espacialmente discordantes y fibrillation se pueden estudiar. Por desgracia, este tipo de información no se puede extraer de las células aisladas, donde la fibrilación no es posible, o de métodos que sólo registran desde una única ubicación en el corazón intacto 12. Por otra parte, la cartografía óptica simultánea de V m y libre SR Ca2 + en el corazón intacto puede proporcionar una nueva herramienta para la evaluación de Ca 2+ anormal manipulación en condiciones patológicas, incluyendo insuficiencia cardíaca. Las anomalías en la SR Ca2 + regulación, incluyendo la activación y la terminación de la SR Ca 2 + en libertad, diastólica SR Ca2 + fuga, y SR Ca 2 + captación - todos los pasos principales en Ca 2+ ciclismo y todos potencialmente alterada en la insuficiencia cardíaca - se puede estudiar directamente. Además, esta metodología también podría ser una herramienta útil para evaluar los efectos de las intervenciones terapéuticas, como RyR estabilización 19 y SERCA modulación 20. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Este enfoque no está exento de limitaciones, sin embargo, incluyendo la baja? F / F como se mencionó anteriormente y la incapacidad para calibrar con precisión los valores de fluorescencia para exigir [Ca 2 +] concentraciones SR. Por desgracia, la variabilidad en la carga de tinte, la excitación no uniforme y la luz de emisiones debido a la superficie curva del corazón, y foto-blanqueo y de fugas de tinte de la SR durante todo el transcurso del experimento hacen que sea extremadamente difícil de calibrar las señales Fluo-5N a exacta [Ca 2 +] SR en el corazón intacto. Estudios previos in vitro en soluciones tampón fisiológicas y miocitos aislados permeabilizada han informado dichas calibraciones y han indicado que los cambios en Fluo-5N fluorescencia son proporcionales a los cambios en la [Ca 2 +] SR y no se espera que la fluorescencia para saturar al fisiológica [Ca 2 +] niveles SR 11. Por lo tanto, los investigadores deben elegir el método de Ca 2+ mapping (tinte de afinidad alta o baja) en base a sus objetivos experimentales específicas e investigaciones fisiológicas.

Dual optical mapping of intracellular Ca2+ and transmembrane potential (Vm) in the intact Langendorff-perfused heart has become a mainstay of investigations in cardiac electrophysiology, including mechanisms of arrhythmia and excitation-contraction coupling1-4. This approach has provided unprecedented knowledge into normal and abnormal electrophysiology and, importantly, into the bidirectional relationship between Vm and intracellular Ca2+. However, optical mapping of intracellular Ca2+ with high-affinity fluorescent indicators (such as Rhod-2 and Fluo-4) only reports on bulk changes in intracellular Ca2+ and is unable to distinguish whether these changes are due to transmembrane Ca2+ flux, release and reuptake into intracellular stores, or in most instances, some combination of both. Furthermore, high-affinity Ca2+ indicators have slow on-off kinetics and may not accurately report rapid changes in Ca2+ concentration5.
Each action potential triggers a rise in intracellular Ca2+, known as the intracellular Ca2+ transient (CaT). In the mammalian heart, approximately 70 &#8211; 90% of the total CaT is due to release of Ca2+ from the sarcoplasmic reticulum (SR) via opening of ryanodine receptors (RyRs)6. Within the SR, approximately half of the total Ca2+ is bound to calsequestrin (CSQ) and other intra-SR buffers7, which play an important role in SR Ca2+ homeostasis8,9. The amount of free SR Ca2+ dictates the driving force for SR Ca2+ release as well as gating of RyR, and therefore has a significant impact on the intracellular CaT. Furthermore, alterations in SR Ca2+ release or reuptake can, in turn, impact Vm via the electrogenic Na+-Ca2+ exchange, which may have arrhythmogenic consequences. Therefore, in addition to the CaT, monitoring of free SR Ca2+ can provide important insights into contractile and electrophysiological dysfunction.
Over the past several years, investigators have made significant advances in the monitoring of SR Ca2+ in isolated cardiac myocytes and from a single location on the intact heart. One such method requires rapid pulses of caffeine to open RyRs and the SR Ca2+ content is then inferred or calculated from the immediate rise in intracellular Ca2+10. Another intriguing approach uses low-affinity Ca2+ indicators, such as Fluo-5N11 or Mag-Fluo412, which bind to free SR Ca2+. These indicators have dissociation constants (Kd) in the range of 10 &#8211; 400 &#956;M and therefore exhibit minimal fluorescence in the cytosol compared to the SR lumen, where the Ca2+ concentration ([Ca2+]SR) is in the millimolar range. Using low-affinity Ca2+ indicators, several aspects of SR Ca2+ cycling have been investigated at the level of the isolated myocyte, including fractional SR Ca2+ release and the mechanisms of Ca2+ alternans13,14. However, in order to fully understand the heterogeneous nature of SR Ca2+ cycling in the intact heart and the role of SR Ca2+ in spatially distinct arrhythmic phenomena, methods for imaging SR Ca2+ across the epicardial surface of the intact heart are required15.
This article describes methodology for dual optical mapping of free SR Ca2+ and Vm in the intact Langendorff-perfused rabbit heart with the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td>Component of Tyrode&#039;s solution</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td>Component of Tyrode&#039;s solution</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S217-500</td><td>Component of Tyrode&#039;s solution</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td>Component of Tyrode&#039;s solution</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-500</td><td>Component of Tyrode&#039;s solution</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-3</td><td>Component of Tyrode&#039;s solution</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td>Component of Tyrode&#039;s solution</td></tr><tr><td>95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>AirGas</td><td>carbogen</td><td>For oxygenation and pH of Tyrode&#039;s solution</td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1760</td><td>Excitation-contraction uncoupler</td></tr><tr><td>RH237</td><td>Biotium</td><td>61018</td><td>Voltage-sensitive dye</td></tr><tr><td>Fluo-5N AM</td><td>Invitrogen</td><td>F-26915</td><td>Low-affinity Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; indicator; Alternative: Invitrogen F-14204; Loading must be performed at room temperature</td></tr><tr><td>Pluronic F127</td><td>Biotium</td><td>59004</td><td>For Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; indicator loading; Warm until the solution is clear before use</td></tr><tr><td>Dimethyl sulphoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>For dissolving blebbistatin and dyes</td></tr><tr><td>Filter</td><td>EMD Millipore</td><td>NY1104700</td><td>11 &amp;#956;m in-line filter</td></tr><tr><td>Pressure Transducer</td><td>WPI</td><td>BLPR2</td><td>For measuring perfusion pressure</td></tr><tr><td>Transbridge Transducer Amplifier</td><td>WPI</td><td>SYS-TBM4M</td><td>For transducing/amplifing pressure signal; PowerLab may also be used with appropriate BioAmp</td></tr><tr><td>PowerLab 26T</td><td>ADInstruments</td><td></td><td>For continuous recording of pressure and ECG signals</td></tr><tr><td>THT Macroscope</td><td>SciMedia</td><td></td><td>Macroscopic optical setup. Details: 0.63X objective (NA = 0.31), 2X condensing objective, resultant field of view = 3.1 cm x 3.1 cm, depth of focus = ~ 1.5 mm</td></tr><tr><td>MiCam Ultima-L CMOS</td><td>SciMedia</td><td></td><td>Optical mapping cameras</td></tr><tr><td>Precision LED Spot Light</td><td>Mightex</td><td>PLS-0470-030-15-S</td><td>LED light source</td></tr></tbody></table>

optical mapping of intra-sarcoplasmic reticulum ca2+ and transmembrane potential in the langendorff-perfused rabbit heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

La figura 1A muestra un diagrama esquemático de la configuración óptica para la doble V m y SR Ca 2+ mapeo. Con esta configuración, no hay separación espectral completa de la V my SR Ca 2 + señales (Figura 1B). Un diagrama del sistema de perfusión de doble bucle utilizado para Fluo-5N colorante de carga se ilustra en la Figura 1C. Figura 1D muestra la orientación horizontal del corazón en el plato de perfusión. Representante V m y SR Ca 2+ trazas óptico durante la estimulación continua desde diferentes ubicaciones en la superficie epicárdica del corazón se muestran en la Figura 2A. El campo óptico de vista con esta configuración es de 31 mm x 31 mm y la orientación del corazón dentro del campo de visión se muestra en la Figura 2B. Mapas de activación también se muestran en la Figura 2B y se construyen mediante la selección del tiempo de activación de cada píxel y pHacer lote este valor en un mapa de isócrono (tenga en cuenta la demora típica de ~ 8 - 10 ms entre la V my SR mapas de activación Ca 2+). Es importante destacar que, potencial de acción clave (AP) propiedades tales como AP tiempo de subida (de 10% a 90% de la amplitud [Taumento]), y la duración AP a 80% de repolarización (APD 80), no son estadísticamente diferentes entre los corazones cargados con RH237 y Fluo-5N en comparación con aquellos cargados con RH237 y Rhod-2 (Taumento: 14.9 ms ± 1,9 ms vs. 14,2 ms ± 1,2 ms y APD 80: 155,3 ms ± 5,8 ms vs. 156,9 ms ± 5,7 ms para Fluo-5N y Rhod-2, respectivamente; p&gt; 0,05 para ambos;. n = 8 / grupo), lo que indica un efecto mínimo de Fluo-5N o colorante de carga en el AP Figura 2C demuestra la capacidad de observar y cuantificar los cambios relativos en la diastólica SR Ca 2+ carga y SR Ca 2 + liberación sistólica amplitudes en diferentes longitudes de ciclo de estimulación. Sólo los cambios relativos en estos parámetros pueden ser Quantified, la calibración absoluta como ([Ca2 +] SR) de la señal en el corazón intacto no es posible. Este enfoque es particularmente útil para caracterizar y cuantificar patológica SR Ca 2+ manipulación, como se muestra en la Figura 3. Después de la aplicación del agonista del receptor adrenérgico isoproterenol-β (100 nM), claro diastólica Ca 2+ fuga de la SR se observa ( flechas rojas, Figura 3a). Si la fuga es lo suficientemente grande, Ca 2 + mediada por actividad desencadenada puede ocurrir (Figura 3B). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53166/53166fig1.jpg" /> Figura 1. Configuración del sistema para Dual Cartografía de V my SR Ca2 +. (A) Esquema de la configuración óptica, incluyendo filtros necesarios y espejo dicroico de separación espectral adecuada. (B) Obtención de imágenes de corazones cargados, ya sea con Fluo-5N solamente (i) o RH237 solamente (ii) indica separación espectral completa de la V y Ca 2+ m señales fluorescentes SR. Ejemplo: excitación, Em:. De emisiones (C) Diagrama del sistema de perfusión de doble bucle para la perfusión normal y Fluo-5N colorante de carga (D) Imagen de un corazón y ECG canulados electrodos en el plato de la perfusión.. Los paneles A y B reproducen con permiso de Wang et al. 15. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53166/53166fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53166/53166fig2.jpg" /> Figura 2. V my SR Ca 2+ huellas óptico durante la estimulación continua y no continua. (A) Representante V my SR Ca2 + Optical traza durante la estimulación continua a una longitud de ciclo de 300 ms. Las señales se muestran a partir de las ubicaciones individuales indicados en (B). Tenga en cuenta el retraso de ~ 8 - 10 ms entre la V my SR Ca2 + tiempos de activación como es típico para el acoplamiento normal de excitación-contracción. (B) Imagen de un corazón dentro del campo de la cartografía de vista (punta de flecha blanca indica el ritmo electrodos) y mapas de activación de V my SR Ca2 +. (C) SR Ca 2+ huellas ópticas que demuestran cambios en la diastólica SR Ca2 + carga y la amplitud de la liberación SR Ca2 + tras los cambios bruscos en la frecuencia de estimulación. Todos los rastros comienzan con estimulación a CL = 300 ms. Frecuencia de estimulación a continuación se cambia bruscamente a la CL = 500 ms (i), CL = 400 ms (ii), o CL = 250 ms (iii). Cuando se inician CLs más largos (I - II), un SR de liberación más grande de Ca 2+ que ocurra primero (debido al intervalo más largo diastólica y recuperación de RyRs) y la diastólica SR Ca2 + carga disminuye ligeramente a un nuevo estado de equilibrio (línea discontinua horizontal). Cuando se inicia una CL más corto, sin embargo, un SR Ca 2+ amplitud menor liberación se produce (debido a la recuperación intervalo más corto diastólica e incompleta de RyRs) y diastólica SR Ca 2+ aumenta la carga a una nueva (línea horizontal de trazos) en estado estacionario . Alternando SR Ca2 + amplitud versión también se produce en CL = 250 ms. S: pequeña amplitud lanzamiento, L: gran amplitud de liberación. (CL: la duración del ciclo) <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53166/53166fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53166/53166fig3.jpg" /> Figura 3. diastólica SR 2+ Ca fugas y actividad desencadenada posterior. (A) en el ECG, V m, y la SR Ca2 + rastros durante la línea base (izquierda) y despuéstratamiento con 100 nM isoproterenol (Iso, derecha). Con Iso, fuga significativa diastólica SR Ca2 + se observa (flechas rojas). Amplitudes de señal SR Ca 2+ se han normalizado antes y después de Iso. El nodo sinoauricular fue la ablación para permitir la estimulación CL = 300 ms en ambos casos. (B) Si SR Ca2 + fuga es lo suficientemente grande, puede desencadenar la actividad focal (complejos ventriculares prematuros, PVC). En este ejemplo, PVC están interrumpiendo el ritmo sinusal normal. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53166/53166fig3large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

En este artículo se describe el protocolo detallado y equipos necesarios para el mapeo óptico dual de potencial transmembrana (V m) y libre retículo intra-sarcoplásmico (SR) Ca 2+ en el corazón de conejo perfundidos Langendorff. Este método permite la observación directa y la cuantificación de V m y SR Ca 2+ dinámica en el corazón intacto.

Mapeo óptico de Intra-retículo sarcoplásmico Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Y potencial transmembrana en el corazón de conejo perfundidos Langendorff

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

optical-mapping-intra-sarcoplasmic-reticulum-ca2-transmembrane

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

9.2K vistas.  University of California Davis.  En este artículo se describe el protocolo detallado y equipos necesarios para el mapeo óptico dual de potencial transmembrana (V m) y libre retículo intra-sarcoplásmico (SR) Ca 2+ en el corazón de conejo perfundidos Langendorff. Este método permite la observación directa y la cuantificación de V m y SR Ca 2+ dinámica en el corazón intacto. 

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Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not have been accomplished by other approaches1. With the use of the calcium- and voltage-sensitive dyes, optical mapping allows measurement of transmembrane action potentials and calcium transients with high spatial resolution without the physical contact with the tissue. This makes measurements of the cardiac electrical activity possible under many conditions where the use of electrodes is inconvenient or impossible1. For example, optical recordings provide accurate morphological changes of membrane potential during and immediately after stimulation and defibrillation, while conventional electrode techniques suffer from stimulus-induced artifacts during and after stimuli due to electrode polarization1. 
The Langendorff-perfused rabbit heart is one of the most studied models of human heart physiology and pathophysiology. Many types of arrhythmias observed clinically could be recapitulated in the rabbit heart model. It was shown that wave patterns in the rabbit heart during ventricular arrhythmias, determined by effective size of the heart and the wavelength of reentry, are very similar to that in the human heart2. It was also shown that critical aspects of excitation-contraction (EC) coupling in rabbit myocardium, such as the relative contribution of sarcoplasmic reticulum (SR), is very similar to human EC coupling3. Here we present the basic procedures of optical mapping experiments in Langendorff-perfused rabbit hearts, including the Langendorff perfusion system setup, the optical mapping systems setup, the isolation and cannulation of the heart, perfusion and dye-staining of the heart, excitation-contraction uncoupling, and collection of optical signals. These methods could be also applied to the heart from species other than rabbit with adjustments to flow rates, optics, solutions, etc.
Two optical mapping systems are described. The panoramic mapping system is used to map the entire epicardium of the rabbit heart4-7. This system provides a global view of the evolution of reentrant circuits during arrhythmogenesis and defibrillation, and has been used to study the mechanisms of arrhythmias and antiarrhythmia therapy8,9. The dual mapping system is used to map the action potential (AP) and calcium transient (CaT) simultaneously from the same field of view10-13. This approach has enhanced our understanding of the important role of calcium in the electrical alternans and the induction of arrhythmia14-16.

This article describes the basic procedures for conducting optical mapping experiments in the Langendorff-perfused rabbit heart using the panoramic imaging system, and the dual (voltage and calcium) imaging modality.

Multiparamétrico óptico Cartografía del corazón de conejo Langendorff perfundidos

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Investigación

Bioingeniería

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

Mapeo óptico de potenciales de acción y transitorios de calcio en el corazón de ratón

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

High-Resolution Endocardial and Epicardial Optical Mapping in a Sheep Model of Stretch-Induced Atrial Fibrillation

Atrial fibrillation (AF) is a complex cardiac arrhythmia with high morbidity and mortality.1,2 It is the most common sustained cardiac rhythm disturbance seen in clinical practice and its prevalence is expected to increase in the coming years.3 Increased intra-atrial pressure and dilatation have been long recognized to lead to AF,1,4 which highlights the relevance of using animal models and stretch to study AF dynamics. Understanding the mechanisms underlying AF requires visualization of the cardiac electrical waves with high spatial and temporal resolution. While high-temporal resolution can be achieved by conventional electrical mapping traditionally used in human electrophysiological studies, the small number of intra-atrial electrodes that can be used simultaneously limits the spatial resolution and precludes any detailed tracking of the electrical waves during the arrhythmia. The introduction of optical mapping in the early 90's enabled wide-field characterization of fibrillatory activity together with sub-millimeter spatial resolution in animal models5,6 and led to the identification of rapidly spinning electrical wave patterns (rotors) as the sources of the fibrillatory activity that may occur in the ventricles or the atria.7-9 Using combined time- and frequency-domain analyses of optical mapping it is possible to demonstrate discrete sites of high frequency periodic activity during AF, along with frequency gradients between left and right atrium. The region with fastest rotors activates at the highest frequency and drives the overall arrhythmia.10,11 The waves emanating from such rotor interact with either functional or anatomic obstacles in their path, resulting in the phenomenon of fibrillatory conduction.12 Mapping the endocardial surface of the posterior left atrium (PLA) allows the tracking of AF wave dynamics in the region with the highest rotor frequency. Importantly, the PLA is the region where intracavitary catheter-based ablative procedures are most successful terminating AF in patients,13 which underscores the relevance of studying AF dynamics from the interior of the left atrium. Here we describe a sheep model of acute stretch-induced AF, which resembles some of the characteristics of human paroxysmal AF. Epicardial mapping on the left atrium is complemented with endocardial mapping of the PLA using a dual-channel rigid borescope c-mounted to a CCD camera, which represents the most direct approach to visualize the patterns of activation in the most relevant region for AF maintenance.

This report provides a detailed description of the methodology and results of simultaneous endocardial and epicardial optical mapping of electrical excitation in the intact left atrium of a Langendorff-perfused sheep heart during stretch-induced atrial fibrillation.

Cartografía de alta resolución óptica endocárdicos y epicárdicos en un modelo de ovejas inducidas por el estiramiento de la fibrilación auricular

 Atrial fibrillation (AF) is a complex cardiac arrhythmia with high morbidity and mortality.1,2 It is the most common sustained cardiac rhythm disturbance ...

Medicina

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

Mapeo óptico de corazones de ratas Langendorff perfundidos

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Biología

Optical Imaging of Isolated Murine Ventricular Myocytes

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances in calcium sensitive dyes have permitted the robust optical recording of single cell calcium dynamics, recording of robust transmembrane optical voltage signals has remained difficult. Arguably, this is because of the low single to noise ratio, phototoxicity, and photobleaching of traditional potentiometric dyes. Therefore, single cell voltage measurements have long been confined to the patch clamp technique which while the gold standard, is technically demanding and low throughput. However, with the development of novel potentiometric dyes, large, fast optical responses to changes in voltage can be obtained with little to no phototoxicity and photobleaching. This protocol describes in detail how to isolate adult murine myocytes which can be used for cellular shortening, calcium, and optical voltage measurements. Specifically, the protocol describes how to use a ratiometric calcium dye, a single-excitation calcium dye, and a single excitation voltage dye. This approach can be used to assess the cardiotoxicity and arrhythmogenicity of various chemical agents. While phototoxicity is still an issue at the single cell level, methodology is discussed on how to reduce it.

We present the methodology for the isolation of murine myocytes and how to obtain voltage or calcium traces simultaneously with sarcomere shortening traces using fluorescence photometry with simultaneous digital cell geometry measurements.

Imágenes ópticas de miocitos ventriculares murinos aislados

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between animal and clinical trials. Numerous animal and cell models have been used to examine the effects of drugs, yet these responses often differ in humans. Human cardiac slices offer an advantage for drug testing in that they are directly derived from viable human hearts. In addition to having preserved multicellular structures, cell-cell coupling, and extracellular matrix environments, human cardiac tissue slices can be used to directly test the effect of innumerable drugs on adult human cardiac physiology. What distinguishes this model from other heart preparations, such as whole hearts or wedges, is that slices can be subjected to longer-term culture. As such, cardiac slices allow for studying the acute as well as chronic effects of drugs. Furthermore, the ability to collect several hundred to a thousand slices from a single heart makes this a high-throughput model to test several drugs at varying concentrations and combinations with other drugs at the same time. Slices can be prepared from any given region of the heart. In this protocol, we describe the preparation of left ventricular slices by isolating tissue cubes from the left ventricular free wall and sectioning them into slices using a high precision vibrating microtome. These slices can then either be subjected to acute experiments to measure baseline cardiac electrophysiological function or cultured for chronic drug studies. This protocol also describes dual optical mapping of cardiac slices for simultaneous recordings of transmembrane potentials and intracellular calcium dynamics to determine the effects of the drugs being investigated.

This protocol describes the procedure for sectioning and culturing human cardiac slices for preclinical drug testing and details the use of optical mapping for recording transmembrane voltage and intracellular calcium signals simultaneously from these slices.

Evaluación de electrofisiología cardíaca preclínica por doble voltaje y mapeo óptico de calcio de cortes cardíacos organotípicos humanos

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Electrophysiological Assessment of Murine Atria with High-Resolution Optical Mapping

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and electrophysiological phenotype in the atria. That encourages us to utilize a genetically-engineered mouse model to elucidate the mechanism of AF. However, it is difficult to evaluate the electrophysiological properties in murine atria due to their small size. This protocol describes the electrophysiological evaluation of atria using an optical mapping system with a high temporal and spatial resolution in Langendorff perfused murine hearts. The optical mapping system is assembled with dual high-speed complementary metal oxide semiconductor cameras and high magnification objective lenses, to detect the fluorescence of a voltage-sensitive dye and Ca2+ indicator. To focus on the assessment of murine atria, optical mapping is performed with an area of 2 mm &#215; 2 mm or 10 mm x 10 mm, with a 100 &#215; 100 resolution (20 &#181;m/pixel or 100 &#181;m/pixel) and sampling rate of up to 10 kHz (0.1 ms) at maximum. A 1-French size quadripolar electrode pacing catheter is placed into the right atrium through the superior vena cava avoiding any mechanical damage to the atrium, and pacing stimulation is delivered through the catheter. An electrophysiological study is performed with programmed stimulation including constant pacing, burst pacing, and up to triple extrastimuli pacing. Under a spontaneous or pacing rhythm, the optical mapping recorded the action potential duration, activation map, conduction velocity, and Ca2+ transient individually in the right and left atria. In addition, the programmed stimulation also determines the inducibility of atrial tachyarrhythmias. Precise activation mapping is performed to identify the propagation of the excitation in the atrium during an induced atrial tachyarrhythmia. Optical mapping with a specialized setting enables a thorough electrophysiological evaluation of the atrium in murine pathological models.

This protocol describes the electrophysiological evaluation of murine atria utilizing an optical mapping system with a high temporal and spatial resolution, including dual recordings of the membrane voltage and Ca2+ transient under programmed stimulation through a specialized electrode catheter.

Evaluación electrofisiológica de Atria murino con mapeo óptico alta resolución

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and ...

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to larger animals. Yet, larger mammals are better suited for translational research questions related to normal cardiac physiology, pathophysiology, and preclinical testing of therapeutic agents. To overcome the technical barriers associated with employing a larger animal model in cardiac research, we describe an approach to measure physiological parameters in an isolated, Langendorff-perfused piglet heart. This approach combines two powerful experimental tools to evaluate the state of the heart: electrophysiology (EP) study and simultaneous optical mapping of transmembrane voltage and intracellular calcium using parameter sensitive dyes (RH237, Rhod2-AM). The described methodologies are well suited for translational studies investigating the cardiac conduction system, alterations in action potential morphology, calcium handling, excitation-contraction coupling and the incidence of cardiac alternans or arrhythmias.

The objective of this study was to establish a method for investigating cardiac dynamics using a translational animal model. The described experimental approach incorporates dual-emission optocardiography in conjunction with an electrophysiological study to assess electrical activity in an isolated, intact porcine heart model.

Estudios de Optocardiografía y Electrofisiología de Corazones Perfundidos Ex Vivo Langendorff

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte monolayers. HL-1 cells have been widely used as a 2-Dimensional cellular model for studying diverse aspects of cardiac physiology. However, it has been a great challenge to optically map calcium (Ca) transients and action potentials simultaneously from the same field of view in a cultured HL-1 atrial cell monolayer. This is because special handling and care is required to prepare healthy cells that can be electrically captured and optically mapped. Therefore, we have developed an optimal working protocol for dual channel optical mapping. In this manuscript, we have described in detail how to perform the dual channel optical mapping experiment. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of action potential propagation and Ca kinetics in arrhythmia development.

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

Tensión y calcio Dual Channel Mapping óptico de Cultivadas HL-1 auricular miocitos monocapa

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts

In the heart, molecular signaling studies are usually performed in isolated myocytes. However, many pathological situations such as ischemia and arrhythmias can only be fully understood at the whole organ level. Here, we present the spectroscopic technique of local field fluorescence microscopy (LFFM) that allows the measurement of cellular signals in the intact heart. The technique is based on a combination of a Langendorff perfused heart and optical fibers to record fluorescent signals. LFFM has various applications in the field of cardiovascular physiology to study the heart under normal and pathological conditions. Multiple cardiac variables can be monitored using different fluorescent indicators. These include cytosolic [Ca2+], intra-sarcoplasmic reticulum [Ca2+] and membrane potentials. The exogenous fluorescent probes are excited and the emitted fluorescence detected with three different arrangements of LFFM epifluorescence techniques presented in this paper. The central differences among these techniques are the type of light source used for excitation and on the way the excitation light is modulated. The pulsed LFFM (PLFFM) uses laser light pulses while continuous wave LFFM (CLFFM) uses continuous laser light for excitation. Finally, light-emitting diodes (LEDs) were used as a third light source. This non-coherent arrangement is called pulsed LED fluorescence microscopy (PLEDFM).

In the heart, molecular events coordinate the electrical and contractile function of the organ. A set of local field fluorescence microscopy techniques presented here enables the recording of cellular variables in intact hearts. Identifying mechanisms defining the cardiac function is critical in understanding how the heart works under pathological situations.

Mapeo óptico de Intra-retículo sarcoplásmico Ca

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