This work was supported by FIRB-Merit grants RBNE08YFN3_005 and RBNE08HWLZ_012, and the Italian Ministry of Economy and Finance to the CNR for the Project &#8220;FaReBio di Qualit&#224;&#8221;.

1. Preparar soluciones siRNA <ol><li> Resuspender 5 nmol de revueltos (Ctrl) y 5 nmol de BRCA2 siRNA gránulos secos en 100 l de RNasa libre de agua (concentración final de siRNA: 50 m). Este es el stock siRNA y debe ser almacenado a -20 ° C en 10 alícuotas. </li><li> Tomar una alícuota de 10 l de la población de siRNA y añadir 40 l de RNasa libre de agua para obtener la solución de trabajo de 10 M siRNA. Esta dilución debe ser almacenado a -20 ° C hasta su uso. NOTA: La solución de trabajo siRNA no debe someterse a la congelación / descongelación de más de 3 veces. </li></ol> 2. Siembra del epiteliales humanas Líneas Celulares <ol><li> Retire el medio de crecimiento de las líneas celulares epiteliales humanas que crecen como monocapas de células en placas de cultivo de tejidos en un incubador humidificado a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Lavar las células en la placa una vez con PBS (RT 10 ml de PBS para una placa de 100 mm). </li><li> Para separar las células de la placa,añadir 2 ml de 0,25% de tripsina / EDTA 0,53 mM solución e incubar 3-5 min dependiendo del tipo de célula. </li><li> Antes de recolectar las células desprendidas, neutralizar la tripsina mediante la adición de 2 ml de medio de crecimiento completo que contenía suero bovino fetal al 10%. </li><li> Transferir las células a un tubo de 15 ml. </li><li> Centrifugar las células a 320-330 xg durante 3 min a 4 ° C en un rotor de cubeta oscilante. </li><li> Resuspender los sedimentos celulares en 5 ml de medio de antibióticos libres. </li><li> Contar las células bajo el microscopio en una cámara de Burker o mediante el uso de un sistema de conteo automatizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Semilla las células en placas de 6 pocillos a ser alrededor del 80% de confluencia después de 24 horas (0,5 a 1 x 10 6 células en 2 ml de medio para cada pocillo). El número de células óptimas que se sembró pueden variar dependiendo de las líneas celulares específicos y la tasa de crecimiento. NOTA: No agregue los antibióticos en el medio en este punto porque los antibióticos interfieren negativamente con la eficiencia de transfección. Es muy importante que las células están en pases de cultivo bajo (&lt;10) para lograr una alta eficiencia de transfección de ARNsi BRCA2. </li></ol> 3. transfectar células con siRNA <ol><li> Veinticuatro horas después de la siembra de las células, proceder con la primera ronda de la transfección. <ol><li> Diluir 6 l de 10 siRNA transfección reactivo específico basado en lípidos en 130 l de medio de suero reducido. </li><li> Diluir 3 l de 10 mM siRNA (30 pmol) en 130 l de medio de suero reducido. </li><li> Combine el siRNA diluida con el reactivo de transfección se diluye y se incuba durante 5-10 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Durante la incubación, retirar el medio de las células y añadir 2 ml de medio fresco pre-calentado a 37 ° C (sin antibióticos). </li><li> Añadir 250 l de los complejos de reactivo de transfección siRNA-a las células (esta cantidad es para un solo pocillo de una placa de 6 pocillos). </li><li> Se incuban las células en un incubador humidificado a 3776; C con 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Después de 24 horas, proceder a la segunda ronda de transfección repitiendo los pasos 3.1.1-3.1.5 con la siguiente modificación para el paso 3.1.2: diluir 5 l de 10 mM siRNA (50 pmol) en 130 l de medio de suero reducido. <ol><li> Se incuban las células durante 1-2 días a 37 ° C antes del análisis. NOTA: Dos rondas de transfecciones y uso de una relación de reactivos de alta siRNA / transfección en la segunda ronda son esenciales para conseguir una alta eficiencia de silenciamiento BRCA2. </li></ol></li></ol> 4. lisar células para el análisis de inmunotransferencia <ol><li> Preparar tampón de lisis fresco con PBS (pH 7,4) que contiene 1% de la no iónico, no desnaturalizante octilfenoxipolietoxietanol detergente, pirofosfato de sodio 5 mM, ortovanadato de sodio 1 mM, fluoruro de sodio 10 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 2 mM, 10 mg / ml de leupeptina, 10 g / ml de aprotinina. Guárdelo en hielo. </li><li> Retire el medio de las células y wcenizas ellos una vez con PBS frío (2 ml / pocillo) en la placa. Para evitar cualquier arrastre PBS, retire completamente de la placa. </li><li> Añadir 200 l de tampón de lisis a cada pocillo. NOTA: Si las células tienen que ser utilizados también para otros ensayos, trypsinize las células como se describe en el paso 2.1 a 2.6 y resuspender las células en tampón apropiado / medio de acuerdo a la aplicación a utilizar. </li><li> Girar suavemente la placa para distribuir uniformemente el tampón de lisis y se incuba durante 15 min a 4 ° C en un rotador. </li><li> Recoger el lisado celular en un tubo de microcentrífuga en hielo utilizando un rascador de células. </li><li> Centrifugar a 17900 xg durante 25 min a 4 ° C y recoger el sobrenadante en un tubo nuevo. </li><li> Medir la concentración de proteína usando un ensayo de proteína disponible comercialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li></ol> Análisis de inmunotransferencia 5. BRCA2 <ol><li> Preparar el tampón de desarrollo diluyendo 50 ml de 20x Tris-Acetato SDS corriendo bUffer (Tricina 50 mM, 50 mM Tris Base, 0,1% SDS, pH 8,24) con 950 ml de agua destilada. </li><li> Preparar la muestra como sigue: añadir 15 g de lisado celular total, 5 l de tampón de muestra 4x que contienen dodecil sulfato de litio a pH 8,4, 2 l de 10x muestra de agente reductor (0.5 M DTT), y tampón de lisis hasta un volumen final de 20 l. NOTA: Este protocolo permite la detección de BRCA2 en líneas de células normales también cuando se utiliza una menor cantidad de proteínas totales (hasta 5 g). </li><li> Desnaturalizar las muestras a 55 ° C durante 10 min. NOTA: Es fundamental utilizar 55 ° C. Dado que la proteína BRCA2 es termosensible 11, las temperaturas de desnaturalización más altos dan lugar a la pérdida constante de larga duración intacta (390 kDa) proteína BRCA2. </li><li> Configurar la cámara electroforética de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Cargar las muestras y 10 l de alto peso molecular pre-manchado estándar de la proteína en un gel prefabricado (Tris-acetato 3-8%) y funcionar a 120 V para abcabo de 2 h 12. Detener la ejecución de electroforesis antes del 55 kDa marcador azul deja el gel prefabricado. </li><li> Preparar el tampón de transferencia con 50 ml de tampón de transferencia de 20x, 100 ml de 100% de metanol y 850 ml de agua. </li><li> Activar membrana de PVDF (0,45 micras de tamaño de poro) por inmersión en metanol al 100% durante 5 minutos, enjuague con agua destilada y se equilibre en tampón de transferencia al menos durante 5 minutos. Remojar las esponjas del aparato de transferencia en tampón de transferencia a 4 ° C hasta su uso. </li><li> Cuando la corrida electroforética es más, armar el sándwich en la pila de la transferencia en el siguiente orden (de abajo arriba): tres esponjas saturadas en tampón de transferencia, una hoja de papel de grado 3MM saturado en tampón de transferencia, el gel, membrana de PVDF se activa, uno 3MM hoja de papel de grado saturado en tampón de transferencia, tres esponjas saturado en tampón de transferencia 13,14. Coloque la pila en las proteínas de aparatos y de transferencia a 350 mA durante 4 horas a 4 ° C oa 180 mA durante la noche a 4 ° C. NOTA: Ser BRCA2 una proteína muy grande, es crucial para extender el tiempo de transferencia de 1 hr (como se sugiere por el fabricante y la mayoría de los protocolos de transferencia) a 4 hr o durante la noche para asegurar la transferencia completa de proteínas de alto peso molecular. Además, debido al tiempo de transferencia de largo, es esencial para realizar la transferencia en una habitación fría a 4 ° C para minimizar el sobrecalentamiento y facilitar el desmontaje sandwich. Sistemas de transferencia semi-secos no son buenas para la transferencia de las proteínas de gran tamaño. </li><li> Después de la transferencia, lavar la membrana con TBS, bloquearlo durante 1 hora a RT en TBS-Tween 0,25% (TBS-T) que contiene leche en polvo desnatada al 5% y la sonda durante la noche a 4 ° C con anticuerpo policlonal de conejo anti-l 30 BRCA2 ( 200 g / ml), se diluyó en 9 ml de TBS-T + 5% leche en polvo desnatada [1: 300 (v / v) de dilución]. </li><li> Se lava la membrana tres veces (10 min cada una) con TBS-T, entonces incubar el filtro durante 1 hora con 1 l de rábano picante conjugada con peroxidasa anti-conejo anticuerpo secundario diluido en 10 ml de TBS-T + 5% leche en polvo desnatada. A partir de entonces, lavar la membrana tres veces (10 min cada uno) con TBS-T. </li><li> Realizar inmunodetección por ECL para revelar proteína BRCA2 mediante un aumento de quimioluminiscencia (ECL) Western Blot reactivo de detección, siguiendo las instrucciones del fabricante. Visualizar bandas immunochemiluminescent en alta resolución de películas ECL. </li><li> Realizar la inmunodetección con un anticuerpo para un gen de mantenimiento, como β-tubulina (55 kDa), en el mismo filtro como control de carga mediante el uso de un anticuerpo monoclonal para β-tubulina diluido a 1: 1000 (10 l de anticuerpo anti-tubulina en 10 ml TBS-T + 5% de leche seca no grasa) durante 1 hora a RT. Lavar y se incuba el anticuerpo secundario como se describe para BRCA2 (5.10 a 5.11), excepto para el uso de rábano picante conjugado con peroxidasa anti-ratón en lugar de anti-anticuerpo secundario de conejo. </li><li> Adquirir una imagen digital de las películas impresionadas con bandas immunochemiluminescent y analizar la intensidad de la banda de imagen dedicada software de análisis (por ejemplo,., ImageJ). </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Debido a que las mutaciones en la línea germinal del gen BRCA2 plomo a un mayor riesgo de varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer femenino y masculino de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, y el melanoma 3,4, una serie de estudios se han realizado para entender la función biológica de la proteína BRCA2. La mayoría de estos estudios son principalmente basados ​​en genética debido a dificultades técnicas en el análisis de una proteína gigante como BRCA2. El método descrito aquí para silenciar y el análisis de expresión de la proteína BRCA2 proporciona una herramienta eficaz para investigar las funciones del gen supresor de tumores BRCA2 en un amplio espectro de ensayos biológicos. El protocolo de silenciamiento se basa en procedimientos de transfección estándar siRNA todavía contiene varias modificaciones cruciales, así como consejos para la caída exitosa y consistente de BRCA2. El protocolo de transfección siRNA es seguro, rápido y eficiente y, a diferencia de shRNA, que por lo general hace uso de lenvectores antiviral, no necesita procedimientos específicos de bioseguridad y se puede realizar fácilmente en cualquier laboratorio equipado con un centro de cultivo de células. Del mismo modo, el protocolo de inmunotransferencia ha sido optimizado para la detección eficiente de una proteína grande como BRCA2. El protocolo de inmunotransferencia también se ha validado para la detección de la proteína BRCA2 humano recombinante expresado de manera heteróloga en células de levadura 9. Varios factores importantes para la prestación eficiente de siRNA se reportan aquí. Incluyen dos ciclos de transfecciones y un alto ratio de siRNA transfección reactivo a, especialmente en el segundo ciclo. La ausencia de antibióticos antes y durante el procedimiento de transfección es otro factor crítico. Sin embargo, este procedimiento expone las células en cultivo a un mayor riesgo de contaminación bacteriana; por tanto, se deben tomar precauciones adicionales para garantizar un alto nivel de esterilidad en todas las etapas. Cabe señalar que, dependiendo del tipo de célula, knockdo génica eficazwn requerirá típicamente de 24-48 hr después del segundo ciclo. El método actual tiene la ventaja de mantener silenciamiento génico bastante estable al menos hasta 7 días después del segundo ciclo de la transfección. Esto permite el estudio de los efectos de BRCA2 caída en una variedad de ensayos biológicos, incluyendo la respuesta celular a diferentes fármacos quimioterapéuticos. Sin embargo, una limitación de la presente técnica está representada por el hecho de que las moléculas de siRNA exógenos no están integrados en el genoma, desmontables por lo tanto estable de la expresión génica no se puede lograr. Por otra parte, para conseguir caída estable, se puede realizar shRNA infección lentiviral, siempre que el laboratorio está preparado para los requisitos de bioseguridad adicionales (normas BSL-2 de acuerdo con las directrices del NIH). Además, cuando la transfección no es un enfoque aplicable para estudiar la función de genes en un tipo específico de célula (por ejemplo., Los linfocitos T), el uso de ratones knockout Brca2 condicional específicos de células sigue siendo el único alternAtive 19. Este método informes también varios consejos para la detección exitosa de una proteína de alto peso molecular por inmunotransferencia y es ideal tanto para proteínas de alta y de baja abundancia. En particular, debido a la termosensibilidad de la proteína BRCA2, una temperatura más baja de desnaturalización es crítico para su detección óptima, de acuerdo con un estudio previo 11. Este &quot;truco&quot; técnica también puede ser útil para otras proteínas para los que la detección por inmunotransferencia protocolos estándar ha sido probada sin éxito. Anticipamos que este método contiene consejos de validez general y por lo tanto puede facilitar el silenciamiento y la detección de muchas otras proteínas desafiantes.

El gen BRCA2 (cáncer de mama susceptibilidad gen-2) codifica para una proteína supresora de tumores que juega un papel crucial en la reparación de ADN de doble filamento se rompe mediante la regulación de la función de la enzima recombinasa Rad51 1. BRCA2 también ha sido implicado en la modulación de la transcripción y en el control del ciclo celular 2. Mutaciones de la línea germinal en el gen BRCA2 inducen una susceptibilidad autosómica dominante a cáncer de mama y de ovario en mujeres y el cáncer de próstata en hombres, así como predisposición a otros tipos de cáncer 3,4. Sin embargo, a pesar del aumento en el riesgo de desarrollar cáncer, mutaciones BRCA2 que suprimen o reducen la función BRCA2 pueden hacer que las células cancerosas sean más vulnerables a los agentes quimioterapéuticos que causan daño en el ADN de 5-7. Cánceres esporádicos presentan una baja tasa de mutaciones BRCA2 (&lt;3%) a pesar de los niveles reducidos de la proteína BRCA2 han sido detectados en algunos tipos de cáncer, lo que sugiere que la proteína BRCA2se puede perder durante la tumorigénesis en cánceres esporádicos a través de mecanismos no mutacional dependientes 7,8. Por lo tanto, es importante para entender completamente las funciones de BRCA2 en el contexto de la biología del cáncer, así como en otros entornos biológicos. Una poderosa herramienta utilizada para identificar nuevas funciones de un gen en células de mamífero es silenciar su expresión. Como un ejemplo, silenciamiento de la expresión de BRCA2 en una variedad de células epiteliales normales ha conducido recientemente a la identificación de una nueva función de BRCA2 como regulador de la resistencia a la anoikis, un paso importante durante la adquisición de la capacidad invasiva de células de cáncer metastásico y 9. El silenciamiento génico puede conseguirse mediante la introducción en las células ya sea de interferencia (SI) de ARN pequeño o corto horquilla (sh) moléculas de ARN dirigidas a la gen específico. La alta potencia de siRNA y su facilidad de uso lo convierten en la herramienta preferente para silenciar a los experimentos encaminados a la obtención de nuevos conocimientos sobre los procesos biológicos críticos unnd para identificar nuevas dianas terapéuticas. Sin embargo, desmontables eficiente de la expresión génica puede no ser fácilmente alcanzable para todos los genes y puede ser muy variable dependiendo del tipo de célula. Debido a una disminución en los niveles de proteína intracelular es el fenotipo más relevante bajo investigación, es crucial para cuantificar el silenciamiento de genes por análisis de inmunotransferencia del producto del gen. Con este sentido, la proteína BRCA2 presenta otro desafío: ser una proteína grande (aproximadamente 390 kDa), existen dificultades técnicas para el análisis bioquímico convencional, incluyendo inmunotransferencia. Presentamos aquí un protocolo optimizado para silenciamiento eficiente de BRCA2 en líneas de células epiteliales humanas y para la detección rápida y exitosa de la proteína BRCA2 desmontables por inmunotransferencia análisis.

<table><tbody><tr><td>BRCA2 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-003462-00</td><td>SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA</td></tr><tr><td>Ctrl siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>&amp;nbsp;D-001810-10-05</td><td>ON-TARGETplus Non-targeting Pool</td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX Reagent&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/13778075&quot;&gt;13778075&lt;/a&gt;</td><td>Transfection Reagent</td></tr><tr><td>OPTI-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td>Medium for transfection procedure</td></tr><tr><td>NuPAGE Tris-Acetate 3-8% 1,5 mm Gel precast</td><td>Life Technologies</td><td>EA0378</td><td>Gel for protein electrophoresis</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample buffer&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>NP0007</td><td>Reagent for protein electrophoresis</td></tr><tr><td>NuPAGE Sample Reducing agent (10x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0004</td><td>Reagent for protein electrophoresis</td></tr><tr><td>NuPAGE Antioxidant</td><td>Life Technologies</td><td>NP0005</td><td>Reagent for protein electrophoresis</td></tr><tr><td>HiMark Pre-stained protein standard</td><td>Life Technologies</td><td>LC5699</td><td>Prestained marker for gel electrophoresis</td></tr><tr><td>XCell SureLoc Mini-Cell&amp;nbsp; System</td><td>Life Technologies</td><td>EI0002</td><td>Equipment for protein electrophoresis/transfer</td></tr><tr><td>NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>LA0041</td><td>Reagent for Western blotting</td></tr><tr><td>PVDF membrane</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>Reagent for Western blotting</td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>NP0006-1</td><td>Reagent for Western blotting</td></tr><tr><td>BRCA2 H-300 rabbit polyclonal antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8326</td><td>1:300 dilution</td></tr><tr><td>Beta-tubulin monoclonal antibody</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4026-100UL</td><td>1:1,000 dilution</td></tr><tr><td>Skim Milk powder</td><td>Sigma Aldrich</td><td>70166</td><td>Reagent for Western blotting</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td>Reagent for Western blotting</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico/Femto Chemiluminescent Substrate</td><td>Pierce Thermo Scientific</td><td>34080/34096</td><td>Chemiluminescence system</td></tr><tr><td>PNT1A cells</td><td>SIGMA Aldrich (for ECACC)</td><td>95012614</td><td>PNT1A human, normal prostate epithelium immortalized with SV40</td></tr><tr><td>Nthy cells</td><td>SIGMA Aldrich (for ECACC)</td><td>90011609</td><td>Nthy-ori 3-1 Cell Line human, thyroid follicular epithelial cells</td></tr><tr><td>Cell Proliferation Kit I (MTT)</td><td>Roche</td><td>11465007001</td><td>Kit for cell proliferation assays</td></tr></tbody></table>

silencing of brca2 to identify novel brca2-regulated biological functions in cultured human cells

El silenciamiento de la proteína BRCA2 supresor de tumores y su detección por análisis bioquímicos convencionales representan un gran desafío técnico debido al gran tamaño de la proteína BRCA2 humano (aproximadamente 390 kDa). Se presenta modificaciones de transfección y inmunotransferencia protocolos estándar siRNA para silenciar BRCA2 humano y detectar la proteína BRCA2 endógeno, respectivamente, en las líneas de células epiteliales humanas. Los pasos clave incluyen una alta proporción de reactivo de transfección siRNA ay dos rondas posteriores de siRNA transfección dentro del mismo experimento. El uso de estas y otras modificaciones en el protocolo estándar logramos consistentemente más de 70% silenciamiento del gen BRCA2 humano a juzgar por el análisis de inmunotransferencia con anticuerpos anti-BRCA2. Además, la desnaturalización de los lisados ​​de células a 55 ° C en lugar de la convencional 70-100 ° C y otras optimizaciones técnicas del procedimiento de inmunotransferencia permite la detección de la proteína BRCA2 intacta incluso when muy bajas cantidades de material de partida están disponibles o cuando los niveles de expresión de proteínas BRCA2 son muy bajos. Silenciamiento eficiente de BRCA2 en las células humanas ofrece una valiosa estrategia para interrumpir la función de BRCA2 en células con BRCA2 intacto, incluyendo las células tumorales, para examinar nuevas vías moleculares y las funciones celulares que pueden ser afectados por mutaciones BRCA2 patógenos en los tumores. La adaptación de este protocolo para el silenciamiento y el análisis de otros &quot;grandes&quot; como proteínas BRCA2 eficiente debe ser fácilmente alcanzable.

Antes de proceder con un ensayo biológico / bioquímica para examinar el efecto de silenciamiento BRCA2 en las funciones celulares, el primer paso es para confirmar la especificidad de la silenciamiento mediante el uso de un siRNA revueltos (no la orientación siRNA) lado a lado con BRCA2 siRNA (Figura 1A ). Es importante llevar a cabo una segunda ronda de siRNA transfección con una alta relación de siRNA / transfección para conseguir una alta eficiencia del silenciamiento BRCA2. De hecho, la realización de una sola ronda de siRNA transfección o mediante un siRNA inferior a la proporción de transfección en la segunda ronda (25 pmol de siRNA y 6 l de reactivo de transfección) se traduciría en una menor eficiencia desmontables (Figura 1B). El segundo paso es evaluar el tiempo mínimo óptimo para conseguir el mayor nivel de silenciamiento génico. Dependiendo del tipo de célula, esto puede variar entre 24 y 48 horas después de la segunda ronda de siRNA transfección. Por ejemplo, 24 horas son suficientes para las células tiroideas Nthy pero hasta el 48hr se necesitan para caída BRCA2 eficiente en células de la próstata PNT1A (Figura 2). silenciamiento BRCA2 es bastante estable hasta 7 días después del segundo ciclo de la transfección (Figura 2B). De la nota, la desnaturalización los lisados ​​celulares a una temperatura por encima de 55 ° C (100 ° C durante 5 min), da como resultado hasta 50% de pérdida de la proteína BRCA2 (Figura 2C), debido a la termosensibilidad de BRCA2 11. Una vez que se estableció el tiempo óptimo silenciamiento, los efectos de la pérdida de la proteína BRCA2 pueden ser explotados en varios ensayos. Dado que las mutaciones in vivo que causan la pérdida de la función de BRCA2 promueven el aumento de la sensibilidad a los inhibidores de PARP así como a otros fármacos quimioterapéuticos que causan daños en el ADN 15-18, un ensayo común es determinar la sensibilidad de las células a la -silenced BRCA2 rucaparib inhibidor de PARP o oloparib. En el experimento reportado en la Figura 3, las células PNT1A agotan of proteína BRCA2 a través de siRNA han sido tratados con 10 mM rucaparib durante 24 horas, después de lo cual la proliferación celular ha sido evaluado por un ensayo de proliferación celular basado en MTT. El agotamiento de los resultados de proteína BRCA2 en una disminución dependiente del tiempo en la proliferación celular después del tratamiento rucaparib (Figura 3). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52849/52849fig1.jpg" /> Figura 1. Dos rondas de transfección y alta siRNA relación reactivo de transfección a mejorar silenciamiento BRCA2. (A) La especificidad de silenciamiento BRCA2 se confirmó en células Nthy por análisis de inmunotransferencia 24 hr después de la segunda ronda de la transfección, usando siRNA revueltos (Ctrl) como control para la comparación de los niveles de proteína BRCA2. Marcadores de peso molecular se indican a la izquierda. (B) las células se sometieron a PNT1A 1 o 2 ciclos de BRCA2 stransfección RNAi como se describe en el protocolo [Ciclos (#) 1 y 2] y la proteína BRCA2 agotamiento se cuantificó por inmunotransferencia. Dos ciclos de transfección con siRNA revueltos fueron utilizados como control (Ctrl). En 2b, las células PNT1A se sometieron a dos ciclos de BRCA2 siRNA transfección utilizando un siRNA menor relación de reactivo de transfección en el segundo ciclo como una modificación (25 pmol siRNA / 6 reactivo de transfección l). En todos los casos, los niveles de proteína BRCA2 se analizaron 48 horas después del segundo ciclo. En la parte inferior, la cuantificación de los niveles de proteína BRCA2 se reporta como relación BRCA2 / tubulina. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52849/52849fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52849/52849fig2.jpg" /> Figura 2. Optimización de caída BRCA2. (A) Optimal BRCA2 caída puede requerir de 24 a 48 horas después de la transfección segundo ciclo de siRNA. Dos líneas celulares diferentes (PNT1A y Nthy) fueron evaluados para BRCA2 desmontables 24 horas y 48 horas después de que el segundo ciclo de la transfección siRNA por inmunotransferencia análisis. En la parte inferior, los niveles de proteína BRCA2 se informan como porcentaje de los niveles en el tiempo 0 horas, fijado en 100. Los datos representan la media ± DE de tres experimentos independientes. (B) caída BRCA2 es estable durante 7 días. Células PNT1A Se evaluó la caída BRCA2, hasta 196 horas después del segundo ciclo de la transfección siRNA por inmunotransferencia. La relación de BRCA2 a la señal de tubulina se informó en la parte inferior. (C) proteína BRCA2 es termosensible. PNT1A células no transfectadas se recogieron 24 h después de la siembra (aproximadamente 70% de confluencia) y se lisaron de acuerdo con el protocolo. Dos alícuotas de la misma lisado de células (15 g de proteínas totales) se desnaturalizaron ya sea a 55 ° C durante 10 min o en &amp; # 100176; C durante 5 min y los niveles de proteína BRCA2 se evaluaron por inmunotransferencia. En la parte inferior, la proporción de BRCA2 a la señal de tubulina se informó. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52849/52849fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52849/52849fig3.jpg" /> Figura 3. BRCA2 silenciamiento aumenta la sensibilidad de las células a la rucaparib inhibidor de PARP. PNT1A ya sea células transfectadas con el control (Ctrl) o BRCA2 siRNA se recogieron 48 h después de la transfección y se sembraron en placa de 96 pocillos (2000 células / pocillo). Después de 24 horas, se añadió 10 mM rucaparib a las células durante 24 horas, después de lo cual las células se mantuvieron en ausencia de la droga hasta 96 horas. La proliferación celular se evaluó en el momento indicado utilizando el ensayo MTT, midiendo la absorbancia a 550-690 nm. Eacpunto h de tiempo representa la media ± SD de tres pozos de un experimento representativo. Ctrl siRNA, línea azul; BRCA2 siRNA, línea roja. En la parte superior, el perfil de proteína BRCA2 en las células transfectadas con siRNA BRCA2 se informó. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52849/52849fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Gene silencing by siRNA represents a convenient experimental strategy to analyze BRCA2-dependent biological functions with immediate implications to better understand cancer biology. A method to efficiently silence BRCA2, along with the experimental procedure to detect and quantify changes in BRCA2 protein expression by immunoblotting in human cell lines, is presented.

Silencios de<em&gt; BRCA2</em&gt; Para identificar las funciones biológicas novedosas BRCA2 reguladas en células humanas cultivadas

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

silencing-brca2-to-identify-novel-brca2-regulated-biological

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

9.0K vistas.  National Research Council. Gene silencing by siRNA represents a convenient experimental strategy to analyze BRCA2-dependent biological functions with immediate implications to better understand cancer biology. A method to efficiently silence BRCA2, along with the experimental procedure to detect and quantify changes in BRCA2 protein expression by immunoblotting in human cell lines, is presented. 

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Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery of the next generation of novel drug targets. It is becoming apparent that more complex models of cancer are required to fully appreciate the contributing factors that drive tumorigenesis in vivo and increase the efficacy of novel therapies that make the transition from pre-clinical models to clinical trials.
Here we present a methodology for generating uniform and reproducible tumor spheroids that can be subjected to siRNA functional screening. These spheroids display many characteristics that are found in solid tumors that are not present in traditional two-dimension culture. We show that several commonly used breast cancer cell lines are amenable to this protocol. Furthermore, we provide proof-of-principle data utilizing the breast cancer cell line BT474, confirming their dependency on amplification of the epidermal growth factor receptor HER2 and mutation of phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PIK3CA) when grown as tumor spheroids. Finally, we are able to further investigate and confirm the spatial impact of these dependencies using immunohistochemistry.

Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.

La utilización de la genómica funcional de selección para identificar dianas farmacológicas potencialmente nueva en la celda cáncer culturas Esferoide

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter assays, embryonic stem cell viability assays, and therapeutic drug-based sensitivity assays. Although they have clarified a lot of BRCA1 variants, these assays involving the use of exogenously expressed BRCA1 variants are associated with overexpression issues and cannot be applied to post-transcriptional regulation. To resolve these limitations, we previously reported a method for functional analysis of BRCA1 variants via CRISPR-mediated cytosine base editor that induce targeted nucleotide substitution in living cells. Using this method, we identified variants whose functions remain ambiguous, including c.-97C&#62;T, c.154C&#62;T, c.3847C&#62;T, c.5056C&#62;T, and c.4986+5G&#62;A, and confirmed that CRISPR-mediated base editors are useful tools for reclassifying the variants of uncertain significance in BRCA1. Here, we describe a protocol for functional analysis of BRCA1 variants using CRISPR-based cytosine base editor. This protocol provides guidelines for the selection of target sites, functional analysis and evaluation of BRCA1 variants.

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

People with BRCA1 mutations have a higher risk of developing cancer, which warrants accurate evaluation of the function of BRCA1 variants. Herein, we described a protocol for functional assessment of BRCA1 variants using CRISPR-mediated cytosine base editors that enable targeted C:G to T:A conversion in living cells.

Evaluación funcional de variantes BRCA1 utilizando editores base mediados por CRISPR

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major contributors to breast cancer initiation, relapse, metastasis and therapy resistance. It is imperative to understand the biology of breast cancer stem cells in order to identify novel therapeutic targets to treat breast cancer. Breast cancer stem cells are isolated and characterized based on expression of unique cell surface markers such as CD44, CD24 and enzymatic activity of aldehyde dehydrogenase (ALDH). These ALDHhighCD44+CD24- cells constitute the BCSC population and can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) for downstream functional studies. Depending on the scientific question, different in vitro and in vivo methods can be used to assess the functional characteristics of BCSCs. Here, we provide a detailed experimental protocol for isolation of human BCSCs from both heterogenous populations of breast cancer cells as well as primary tumor tissue obtained from breast cancer patients. In addition, we highlight downstream in vitro and in vivo functional assays including colony forming assays, mammosphere assays, 3D culture models and tumor xenograft assays that can be used to assess BCSC function.

This experimental protocol describes the isolation of BCSCs from breast cancer cell and tissue samples as well as the in vitro and in vivo assays that can be used to assess BCSC phenotype and function.

Aislamiento y evaluación funcional de células madre de cáncer de mama humano a partir de muestras de células y tejidos

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

Perfiles de microARN regulados por estrógeno en las células del cáncer de mama

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Medicina

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same pathway, are likely to fail. Emphasis must be placed upon the inhibition of pathways that are responsible for intrinsic and/or adaptive resistance to therapy. An active field of investigation is the development and testing of DNA repair inhibitors that promote the action of, and prevent resistance to, commonly used chemotherapy and radiotherapy. We used a novel protocol to evaluate the effectiveness of BRCA2 inhibition as a means to sensitize tumor cells to the DNA damaging drug cisplatin. Tumor cell metabolism (acidification and respiration) was monitored in real-time for a period of 72 hr to delineate treatment effectiveness on a minute by minute basis. In combination, we performed an assessment of metastatic frequency using a chicken embryo chorioallantoic membrane (CAM) model of extravasation and invasion. This protocol addresses some of the weaknesses of commonly used in vitro and in vivo methods to evaluate novel cancer therapy regimens. It can be used in addition to common methods such as cell proliferation assays, cell death assays, and in vivo murine xenograft studies, to more closely discriminate amongst candidate targets and agents, and select only the most promising candidates for further development.

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.

Evaluación de la efectividad del medicamento para el cáncer Sensibilización<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same ...

Identifying the Effects of BRCA1 Mutations on Homologous Recombination using Cells that Express Endogenous Wild-type BRCA1

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the BRCA1 have been complicated by the lack of a robust assay for the full length BRCA1 protein and the difficulties inherent in working with cell lines that express hypomorphic BRCA1 protein1,2,3,4,5. We developed a system whereby the endogenous BRCA1 protein in a cell was acutely depleted by RNAi targeting the 3'-UTR of the BRCA1 mRNA and replaced by co-transfecting a plasmid expressing a BRCA1 variant. One advantage of this procedure is that the acute silencing of BRCA1 and simultaneous replacement allow the cells to grow without secondary mutations or adaptations that might arise over time to compensate for the loss of BRCA1 function. This depletion and add-back procedure was done in a HeLa-derived cell line that was readily assayed for homologous recombination activity. The homologous recombination assay is based on a previously published method whereby a recombination substrate is integrated into the genome (Figure 1)6,7,8,9. This recombination substrate has the rare-cutting I-SceI restriction enzyme site inside an inactive GFP allele, and downstream is a second inactive GFP allele. Transfection of the plasmid that expresses I-SceI results in a double-stranded break, which may be repaired by homologous recombination, and if homologous recombination does repair the break it creates an active GFP allele that is readily scored by flow cytometry for GFP protein expression. Depletion of endogenous BRCA1 resulted in an 8-10-fold reduction in homologous recombination activity, and add-back of wild-type plasmid fully restored homologous recombination function. When specific point mutants of full length BRCA1 were expressed from co-transfected plasmids, the effect of the specific missense mutant could be scored. As an example, the expression of the BRCA1(M18T) protein, a variant of unknown clinical significance10, was expressed in these cells, it failed to restore BRCA1-dependent homologous recombination. By contrast, expression of another variant, also of unknown significance, BRCA1(I21V) fully restored BRCA1-dependent homologous recombination function. This strategy of testing the function of BRCA1 missense mutations has been applied to another biological system assaying for centrosome function (Kais et al, unpublished observations). Overall, this approach is suitable for the analysis of missense mutants in any gene that must be analyzed recessively.

We provide a method for testing BRCA1 variants in a tissue culture based assay for homologous recombination repair of DNA damage by depleting endogenous BRCA1 protein from a cell using RNAi and replacing it with a BRCA1 point mutant that contains a coding change.

La identificación de los efectos de las mutaciones BRCA1 en recombinación homóloga utilizando células que expresan endógeno de tipo salvaje BRCA1

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the ...

Biología

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among traditional technologies, RNA interference suffers from partial target abrogation and the requirement for life-long treatments. In contrast, artificial nucleases can impose stable gene inactivation through induction of a DNA double strand break (DSB), but recent studies are questioning the safety of this approach. Targeted epigenetic editing via engineered transcriptional repressors (ETRs) may represent a solution, as a single administration of specific ETR combinations can lead to durable silencing without inducing DNA breaks.
ETRs are proteins containing a programmable DNA-binding domain (DBD) and effectors from naturally occurring transcriptional repressors. Specifically, a combination of three ETRs equipped with the KRAB domain of human ZNF10, the catalytic domain of human DNMT3A and human DNMT3L, was shown to induce heritable repressive epigenetic states on the ETR-target gene. The hit-and-run nature of this platform, the lack of impact on the DNA sequence of the target, and the possibility to revert to the repressive state by DNA demethylation on demand, make epigenetic silencing a game-changing tool. A critical step is the identification of the proper ETRs&#39; position on the target gene to maximize on-target and minimize off-target silencing. Performing this step in the final ex vivo or in vivo preclinical setting can be cumbersome.
Taking the CRISPR/catalytically dead Cas9 system as a paradigmatic DBD for ETRs, this paper describes a protocol consisting of the in vitro screen of guide RNAs (gRNAs) coupled to the triple-ETR combination for efficient on-target silencing, followed by evaluation of the genome-wide specificity profile of top hits. This allows for reduction of the initial repertoire of candidate gRNAs to a short list of promising ones, whose complexity is suitable for their final&#160;evaluation in the therapeutically relevant setting of interest.

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Here, we present a protocol for the in vitro selection of engineered transcriptional repressors (ETRs) with high, long-term, stable, on-target silencing efficiency and low genome-wide, off-target activity. This workflow allows for reducing an initial, complex repertoire of candidate ETRs to a short list, suitable for further evaluation in therapeutically relevant settings.

In vitro Selección de represores transcripcionales diseñados para el silenciamiento epigenético dirigido

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among ...

Bioingeniería

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

Screening siRNA para identificar ubiquitina y reguladores del sistema ubiquitina-como de las vías biológicas en células de mamífero en cultivo

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on cancer, and especially cancer genetics. Current knowledge and future discoveries will make it necessary to study a huge number of genes that could be involved in a genetic predisposition to cancer. In this regard, we developed a Nextera design to study 11 complete genes involved in DNA damage repair. This protocol was developed to safely study 11 genes (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, and TP53) from promoter to 3&#39;-UTR in 24 patients simultaneously. This protocol, based on transposase technology and gDNA enrichment, gives a great advantage in terms of time for the genetic diagnosis thanks to sample multiplexing. This protocol can be safely used with blood gDNA.

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.

gDNA Enriquecimiento por una tecnología basada en la transposasa de Análisis NGS de la secuencia entera de<em&gt; BRCA1</em&gt;,<em&gt; BRCA2</em&gt;, y 9 genes involucrados en la reparación del ADN daños

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.

Silencios de

Resumen

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