Unsere Arbeit konzentriert sich auf die Entwicklung und den Einsatz von Einzelmolekül-Methoden zur Untersuchung der Dynamik in komplexen biologischen Systemen. Insbesondere sind wir daran interessiert zu erfahren, wie sich DNA-Polymerasen verhalten, wenn sie auf Hindernisse stoßen, in diesem Fall auf G-Quadruplexe. Wir haben eine Einzelmolekülmethode entwickelt, die auf der Fluoreszenzvisualisierung basiert und es uns ermöglicht, das Verhalten einzelner DNA-Polymerasen zu sehen, wenn sie auf einen G-Quadruplex treffen.
Mit unserem Assay haben wir einen bisher nicht charakterisierten Austauschweg für DNA-Polymerase delta beim Auftreffen auf G-Quadruplexe identifiziert, bei dem die Polymerase abfällt und eine neue wieder bindet. Mit unserem entwickelten Protokoll haben wir endlich die Frage beantwortet: Wie verhalten sich verschiedene DNA-Polymerasen, wenn sie auf einen G-Quadruplex treffen, da wir in Echtzeit sehen können, wie sich die Kinetik und Mechanik im Laufe der Zeit verändern? Entfernen Sie zunächst ein funktionalisiertes Deckglas aus einem Vakuum und legen Sie es auf ein teilweise mit Wasser gefülltes Mikroröhrchengestell, um eine feuchte Umgebung zu schaffen.
Pipettieren Sie 100 Mikroliter eines Blockierungspuffers in ein Röhrchen, fügen Sie dann 25 Mikroliter NeutrAvidin-Lösung hinzu und mischen Sie gut. Verteilen Sie die Lösung auf der Oberfläche des Deckglases und lassen Sie sie 15 Minuten bei Raumtemperatur in der Feuchtbox inkubieren. Waschen Sie anschließend den Deckbezug mit Wasser und trocknen Sie ihn dann mit Stickstoffgas.
Platzieren Sie einen maßgefertigten Polydimethylsiloxan-Block auf dem Deckglas in einem Durchflusszellenhalter. Führen Sie Polyethylenschläuche in die Löcher in der Durchflusszelle ein. Erhitzen Sie nun ein Milliliter Aliquote des Tween-Blockierungspuffers, 500 Mikroliter Waschpuffer und des Replikationspuffers 15 Minuten lang auf 40 Grad Celsius, um Gase aus den Lösungen freizusetzen.
Entgasen Sie die Lösungen in einer Vakuumkammer für weitere 15 Minuten bei 800 Millibar unter Atmosphärendruck. Tragen Sie einen Tropfen Öl auf das Objektiv auf. Nehmen Sie eine konstruierte Durchflusszelle und stellen Sie sie auf den Mikroskoptisch.
Heben Sie dann das Ziel an, um das Deckglas zu treffen. Führen Sie den Einlassschlauch in den entgasten Tween-Blockierpuffer ein und verbinden Sie den Auslass mit der Spritzenpumpe. Ziehen Sie dann die Spritze zurück, um den Tween-Blockierungspuffer durch den Schlauch in den Kanal zu ziehen.
Fließen Sie 200 Mikroliter entgasten Waschpuffer mit einer Geschwindigkeit von 100 Mikrolitern pro Minute in den Kanal, um den Tween-Blockierungspuffer auszuspülen. Verdünnen Sie nun die DNA-Matrizenlösungen auf 0,5 Pikomolare in 500 Mikrolitern Replikationspuffer. Lassen Sie 150 Mikroliter der Lösung mit einer Geschwindigkeit von 10 Mikrolitern pro Minute in den Kanal fließen.
Beleuchten Sie die Probe mit einem 647-Nanometer-Laser mit einer Geschwindigkeit von etwa 900 Milliwatt pro Quadratzentimeter in der Probenebene, um einzelne DNA-Templates zu visualisieren. Sobald eine ausreichende Dichte an Flecken sichtbar ist, fließen Sie eine frische Lösung aus Replikationspuffer ein, um überschüssige DNA auszuwaschen. Wechseln Sie in ein neues Sichtfeld und nehmen Sie ein Bild der DNA auf, um den Grad der Kolokalisation zwischen der markierten Polymerase und dem DNA-Substrat zu bestimmen.
Sobald der Vorgang abgeschlossen ist, erhöhen Sie die Laserleistung, um die verbleibenden Flecken zu photobleichen. Bereiten Sie als Nächstes eine Polymeraselösung her, die Dithiothreitol, dNTPs und eine Fluoreszenzsonde im Replikationspuffer enthält. Fließen Sie 100 Mikroliter der Polymeraselösung mit einer Geschwindigkeit von fünf Mikrolitern pro Minute in den Kanal ein.
Sobald sich die Probe im Fokus befindet und der Fluoreszenzwinkel der Totalreflexion eingestellt wurde, stellen Sie die Laserleistung des 647-Nanometer-Lasers in der Probenebene auf etwa 900 Milliwatt pro Quadratzentimeter ein. Beginnen Sie mit der Abbildung des Sichtfelds für die gewünschte Zeitspanne. Die G-Quadruplex-Sequenz blockierte die Polymerase-Delta-Synthese, was durch das Vorhandensein einer 60-Nukleotid-Bande im Seitengel angezeigt wird, während das Kontrollsubstrat ohne den G-Quadruplex eine 100-Nukleotid-Bande erzeugte.
Die Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie bestätigte, dass die Polymerase-Delta auf dem G-Quadruplex-Substrat eine kürzere Verweilzeit von sechs plus oder minus zwei Sekunden aufwies, verglichen mit dem Kontrollsubstrat, das eine Verweilzeit von 11 plus oder minus drei Sekunden aufwies. Die Anzahl der Polymerase-Delta-Bindungsereignisse war auf dem G-Quadruplex-Substrat im Vergleich zur Kontrolle signifikant höher, was auf mehrere Bindungs- und Entbindungszyklen aufgrund der Syntheseblockade hindeutet.
