Unser Ziel ist es, spezifische Untergruppen humaner UC-MSCs zu isolieren und ihre grundlegenden Eigenschaften entsprechend ihrer einzelzellulären transkriptomischen Faktoren zu analysieren. Wir versuchen zu beantworten, welche Merkmale und Funktionen für verschiedene UC-MSC-Subpopulationen vorhanden sind. Die jüngsten Entwicklungen auf unserem Gebiet sind die Entdeckung der Heterogenität gemischter MSC-Populationen, meist durch Einzelzell-RNA-Sequenzierung.
Wir identifizierten die drei Subpopulationen innerhalb der humanen UC-MSCs, einschließlich BAMBI-Zellen mit hohem MFGE8-Gehalt. Diese Untergruppe weist einen ausgeprägten Phänotyp, ein einzigartiges transkriptomisches Profil, ein begrenztes adipogenes Potenzial und eine verminderte immunsuppressive Aktivität bei Lupusnephritis auf. Diese Ergebnisse verbessern das Verständnis von UC-MSCs und unterstützen die Auswahl optimaler Untergruppen für die Behandlung bestimmter Krankheiten.
Wir ebnen den Weg für das Verständnis der tatsächlichen Funktionen nicht nur der BAMBI-hohen MFGE8-hohen UC-MSCs, sondern auch der beiden anderen Untergruppen, insbesondere ihrer Rolle bei der Behandlung verschiedener Krankheiten. Wir werden uns weiterhin darauf konzentrieren, Anwendungen von humanen UC-MSC-Untergruppen bei mehreren immunvermittelten Krankheiten zu starten und ihre molekularen Mechanismen bei der Behandlung dieser Krankheiten zu erforschen. Um BAMBI-hohe MFGE8-hohe UC-MSCs zu isolieren, kultivieren Sie UC-MSC mit einer Dichte von etwa 5 bis 10 mal 10 hoch 6 Zellen in vollständigem DMEM.
Fügen Sie fünf Minuten lang 0,5 millimolare EDTA hinzu, um die Zellen zu dissoziieren. Fügen Sie dann das vollständige DMEM hinzu und übertragen Sie die Zellsuspension in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Pipettieren Sie die Zellsuspension mehrmals auf und ab, um eine Einzelzellsuspension herzustellen.
Nehmen Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und berechnen Sie die Gesamtzahl der geernteten Zellen. Nach der Zählung zentrifugieren Sie die erforderliche Anzahl von Zellen fünf Minuten lang bei 300 g.
Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter des vollständigen Mediums, um eine Konzentration von 5 bis 10 mal 10 hoch 6 Zellen pro Milliliter zu erreichen, und stellen Sie das Röhrchen auf Eis. Als nächstes teilen Sie die geernteten Zellen in vier 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen auf. Die Primärantikörper werden in einer Verdünnung von 1 bis 100 in MFGE8- und BAMBI-Röhrchen gegeben.
Mischen Sie den Inhalt gründlich und inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Fügen Sie nach der Inkubation PBS hinzu, um die markierten Zellen zu waschen. Die Röhrchen werden fünf Minuten lang bei 300 g zentrifugiert und der Überstand verworfen, bevor das Pellet in einem Milliliter des vollständigen Mediums wieder suspendiert wird.
Geben Sie die konjugierten fluoreszierenden Sekundärantikörper in einer Verdünnung von 1 bis 1.000 zu den resuspendierten Zellen. Mischen Sie gründlich und inkubieren Sie die Röhrchen bei Raumtemperatur im Dunkeln vier 15 Minuten. Nach der Inkubation PBS hinzufügen und zentrifugieren, um die markierten Zellen zu waschen.
Suspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern vollständigem Medium und filtrieren Sie es durch ein 70-Mikrometer-Zellensieb, um Klumpen und Schmutz zu entfernen. Übertragen Sie das Filtrat in ein 15-Milliliter-Röhrchen für die Durchflusszytometrie-Sortierung. Führen Sie das leere Zellröhrchen als Negativkontrolle durch, ohne einen Antikörper hinzuzufügen.
Passen Sie die Einstellungen für Vorwärtsstreuung und Seitenstreuung am Durchflusszytometer an, um die Gating-Skala für die ungefärbte Population festzulegen. Führen Sie dann die mit Einzelantikörpern markierten MFGE8 und BAMBI als Gating-Kontrolle aus, um zu bestimmen, wo die Positivität im Diagramm beginnt. Führen Sie die experimentellen Probenröhrchen aus, um die BAMBI-Population mit hohem MFEG8-Gehalt zu sortieren und die sortierten Zellen zu sammeln.
Füllen Sie die sortierten MSCs in eine 24-Well-Platte und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Sobald die sortierten Zellen durch zwei Gänge gewachsen sind, führen Sie eine Durchflusszytometrie-Analyse durch, um die Reinheit der sortierten Population zu bestätigen. Kultivierte UC-MSCs waren stark positiv für die CD44-, CD73-, CD90- und CD105-Expression und negativ für die CD14-, CD34-, CD45-, CD79- und HLA-DR-Expression.
BAMBI-hohe MFEG8-hohe MSCs wurden aus kultivierten humanen UC-MSCs sortiert, und es wurde bestätigt, dass ihre erhöhten BAMBI- und MFEG8-Expressionswerte über drei bis vier Passagen hinweg bestehen bleiben. Die Häufigkeit von BAMBI-hohen MFEG8-hohen MSCs variierte je nach Spender- und Dissoziationsmethode.
