Wir untersuchen die Mikrobiota, die in Pilzgärten auf pilzzüchtenden Ameisen leben. Wir wollen wissen, wer sie sind und wie sie dieses mikrobielle Ökosystem organisieren. Insbesondere wollen wir wissen, wie die Mikrobiota physisch mit dem Pilz interagiert, den die Ameisen kultivieren.
Und diese Wechselwirkungen werden meist durch den Biofilm vermittelt. Der von den Ameisen kultivierte mikrobielle Garten ist eine komplexe und heterogene Probe, die sich aus dem kultivierten Pilz, dem für die Kultivierung hinzugefügten Substrat und der Mikrobiota zusammensetzt. Abgesehen davon, dass es sehr heikel ist, ist es schwierig, Methoden zu finden, die alle Gartenkomponenten für die Bildgebung erhalten.
Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Mikrobiota die Strukturen des Pilzgartens integriert, was auch dafür spricht, dass sie an den physiologischen Reaktionen dieser Umgebung teilnehmen können. Und wir liefern auch den Beweis, dass Biofilme für diese Wechselwirkungen wichtig sind. Unser Protokoll bewahrt Pilzstrukturen in Biofilmen und vereinfacht gleichzeitig andere Prozesse.
Dennoch bleibt die filigrane Gartenstruktur erhalten, indem sie die physische Interaktion der Mikrobiota weiter detailliert beschreibt und die räumliche Struktur des Biofilms enthüllt. Biofilme sind zelluläre Systeme, in denen Mikroorganismen, die in eine EPS-Matrix eingebettet sind, soziale Netzwerke bilden. Die Rasterelektronenmikroskopie ermöglicht es uns, in bisher unerreichter Detailgenauigkeit zu beobachten, wie sich die Mikrobiota im Pilzgarten, in der Umgebung der Hyphen und auf dem gesamten Substrat räumlich organisiert.
Wir glauben, dass die hier vorgeschlagenen Vorbereitungsschritte in großem Umfang angewendet werden, um Studien in anderen mikrobiellen Ökosystemen zu verfeinern. Um zu beginnen, lokalisieren und markieren Sie die Kolonie der Attinameisenart. Heben Sie einen Graben aus, der den Nestbereich umgibt, bis die Gartenkammer freigelegt ist.
Öffnen Sie die Gartenkammer seitlich, um zu verhindern, dass die Erde über die Gartenoberfläche zusammenbricht. Sammeln Sie mit einer entomologischen Pinzette vorsichtig Gartenproben. Füllen Sie die Gartenproben in einen sauberen Plastikbehälter um, der eine Schicht Putz enthält, um die Feuchtigkeit auszugleichen.
Verschließen Sie den Behälter nach dem Transfer der Garten- und Ameisenarbeiter hermetisch, um ein Austrocknen der Probe zu verhindern. Schließen Sie den Graben mit der zuvor entfernten Erde. Lagern Sie die Gartenproben bis zur Weiterverarbeitung bei 23 bis 25 Grad Celsius.
Verwenden Sie zur Probenfixierung eine entomologische Pinzette, um Arbeiterinnen, Eier, Puppen und Larven aus den Gartenproben zu entfernen. Legen Sie Gartenfragmente, die nicht größer als fünf Kubikmillimeter sind, beiseite und geben Sie sie in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie dann mit einer Pasteurglaspipette etwa einen Milliliter Karnofsky-Fixierlösung in die Röhrchen, um die Proben vollständig einzutauchen.
Rühren Sie das Röhrchen vorsichtig um, um die Proben einweichen zu lassen und die Proben mindestens 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius zu inkubieren. Zu Beginn erhalten Sie Fragmente der Kolonie von Attinameisenarten in Karnofsky-Fixierlösung. Nach der Fixierung die Karnofsky-Fixierlösung mit einer Glaspipette vollständig entfernen, ohne die Probe zu beschädigen.
Inkubieren Sie die Probe seriell mit einem Milliliter steigender Ethanolkonzentrationen, um sicherzustellen, dass die Probe ungestört bleibt. Nachdem Sie das Ethanol vollständig entfernt haben, wird die Probe mit einer Pinzette und einem Spatel vorsichtig in einen Probenbehälter für den Trockner für den kritischen Punkt überführt. Setzen Sie den Deckel auf den Behälter und tauchen Sie ihn in ein Messglas, das genügend 100 % Ethanol enthält, um den Behälter einzutauchen.
Füllen Sie dann das Probengefäß in ein anderes Messglasbecherglas um, das genügend 100 % Ethanol enthält. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Übergeben Sie dann den Behälter in den Trockner für kritische Punkte.
Zu Beginn erhalten Sie Fragmente von Ameisenkolonien, die einer Trocknung an kritischen Punkten unterzogen wurden. Um die Probenhalter vorzubereiten, wickeln Sie die Stummel mit einem Stück Alufolie ein und bedecken Sie nur die Oberseite. Schreiben Sie den Beispielcode oder die Nummer auf die Unterseite jedes Stubs, um sie zu identifizieren, bevor Sie den oberen Teil der Stubs mit doppelseitigem Kohleband abdecken.
Öffnen Sie dann den Deckel des Probenbehälters und geben Sie die getrocknete Probe vorsichtig mit einer Pinzette und einem Spatel in eine Petrischale aus Glas. Legen Sie Fragmente der Gartenprobe vorsichtig auf die klebrige Oberfläche des mit Klebeband bedeckten Stummels. Nach der Sputterbeschichtung mit Gold legen Sie die Stummel in den Probenhalter für die Rasterelektronenmikroskopie.
Verwenden Sie entweder die Optionen auf dem Bildschirm oder die manuelle Steuerung, um die Vergrößerung und die Bildposition anzupassen. Verschieben Sie den Tisch, um eine umfassende Ansicht der Probe zu erhalten. Nutzen Sie die FDC-Funktion, um sich auf bestimmte Bereiche zu konzentrieren.
Wenn Sie eine interessante Struktur beobachten, passen Sie die Vergrößerung, den Fokus, die Helligkeit, den Kontrast und die Stigmatation entsprechend an. Um die Stigmatisierung zu korrigieren, verschieben Sie die Bühne mithilfe der manuellen Benutzeroberfläche in die X- und Y-Richtung. Passen Sie die Rasterrate an, um die Bildauflösung zu überprüfen.
Passen Sie die Vergrößerung entsprechend dem abzubildenden Teil an. Um das Bild zu speichern, verwenden Sie die Einfrierfunktion und klicken Sie auf das Fotosymbol. Richten Sie den Dateipfad zum Speichern des Bildes ein.
Analysieren Sie schließlich mindestens drei Gartenfragmente und nehmen Sie Bilder in allen genannten Vergrößerungsbereichen auf. Pilzhyphen in Attinegärten wurden als intakte röhrenförmige Strukturen beobachtet, die die Substratoberfläche bedecken, was auf eine effektive Probenvorbereitung hinweist. Spread-Biofilme bestanden aus mikrobiellen Zellen, die eine dünne ein- bis dreizellige Schicht bildeten, die die Substratoberfläche bedeckte.
