Warum ist dieses Protokoll wichtig? Nun, Hirnmetastasen sind sehr schwierig zu behandeln und dieses Protokoll erzeugt ein klinisch relevantes Mausmodell mit minimalen extrakraniellen Tumoren. Diese Technik ermöglicht eine objektive Analyse der Medikamentenverteilung und des Ansprechens von intrakraniellen Tumoren.
Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das Modell sehr gut reproduzierbar ist und sich die Hirnmetastasen in relativ kurzer Zeit nach der Injektion entwickeln. Der Krankheitsverlauf ist bei Tieren ähnlich, was es den Forschern erleichtert, die Experimente, Behandlungszeitpläne und Endpunkte zu standardisieren. Mein Rat für Anfänger ist, die Verwendung der Pinzette und der Spritze zu üben, während Sie durch das Dissektionsmikroskop schauen, sich mit den anatomischen Landmarken um den Hals vertraut machen und das Protokoll in Anwesenheit eines Tierarztes üben.
Beginnen Sie mit der Aussaat von BT-474-Krebszellen mit einer Seeding-Dichte von zwei mal 10 zu den sechs Zellen in einen T-75-Kolben mit 10 Milliliter komplettem Wachstumsmedium und -kultur, bis die Zellen vor der Injektion einen Konfluency von 70 bis 80% erreichen. Verwerfen Sie am Tag der Injektion Wachstumsmedien und waschen Sie die Zellmonoschicht zweimal mit PBS und fügen Sie fünf Milliliter vorgewärmtes Zellkultur-Dissoziationsreagenz hinzu. Bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten inkubieren oder bis sich die Zellen gelöst haben.
Nach fünf Minuten den Kolben aus dem Inkubator nehmen und vorsichtig darauf klopfen, um die Zellablösung zu unterstützen. Fügen Sie fünf Milliliter komplettes Wachstumsmedium mit 10% FBS hinzu, um die Dissoziationsreagenzaktivität zu löschen. Resuspendieren Sie die Zellen in der Lösung vorsichtig durch Pipettieren, um Zellklumpen zu reduzieren.
Die Zellsuspension in ein 50-Milliliter-Röhrchen geben und bei 180 G drei Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 Milliliter HBSSS ohne Kalzium und Magnesium, um die Zellverklumpung zu minimieren. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 180 G für drei Minuten bei Raumtemperatur Dekantieren Sie den Überstand, um Restserum oder Dissoziationsreagenz zu entfernen und das Zellpellet in drei Milliliter HBSS zu resuspendieren.
Legen Sie ein 100-Mikrometer-Zellsieb auf ein frisches 50-Milliliter-konisches Röhrchen und führen Sie die Zellsuspension durch, um Zellklumpen zu entfernen. Berechnen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen mit Trypanblau und verdünnen Sie die Zellsuspension mit HBSS auf eine Zellkonzentration von 2,5 mal 10 zu den sechs Zellen pro Milliliter. Halten Sie das Rohr waagerecht auf Eis und schaukeln Sie das Rohr regelmäßig vorsichtig, um ein Verklumpen zu minimieren.
Die Zellsuspension kann maximal sechs Stunden auf Eis gelagert werden. Ear-Punch-Maus zur Identifizierung und verwenden Sie elektrische Haarschneider, um das Fell aus dem Halsbereich zu rasieren. Reinigen Sie überschüssiges Haar von der exponierten Haut mit Klebeband.
Tragen Sie Augengleitmittel auf die Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern. Sichern Sie die Maus vorsichtig, indem Sie die oberen Schneidezähne mit einem Faden einhaken, der auf das OP-Brett geklebt ist, gefolgt von Kleben der Vorder- und Hinterbeine. Dieser Schritt verlängert den Körper und hält den Hals während des Eingriffs gerade.
Für die präoperative Hautvorbereitung wischen Sie den Hals mit einem topischen Antiseptikum wie Povidonjod ab, um die Belastung der Hautmikroflora zu reduzieren und loses Haar zu entfernen. Reinigen Sie von der Mitte der Haut und arbeiten Sie nach außen, um eine Rekontamination der Inzisionsstelle zu verhindern. Wiederholen Sie den Vorgang mit 70% Ethanol und führen Sie drei abwechselnde Runden Jod und Ethanol zur Desinfektion durch.
Überprüfen Sie den Reflex über den Pinch-Test, um den Tod der Anästhesie sicherzustellen, bevor Sie den Eingriff fortsetzen. Legen Sie einen sterilen chirurgischen Vorhang über das Tier. Machen Sie unter dem Dissektionsmikroskop einen vertikalen 15-Millimeter-Schnitt entlang der Mittellinie im Halsbereich der Maus mit einer Schere, beginnend von fünf Millimetern unterhalb des Kiefers bis zum Thoraxeinlass.
Verwenden Sie zwei Paar abgewinkelte Pinzetten, teilen Sie die Haut und die darunter liegenden Speicheldrüsen und tragen Sie Retraktoren auf, um die Luftröhre freizulegen. Mit zwei Paar fein abgewinkelter Pinzetten das Muskel- und Fettgewebe neben der Luftröhre stumpf sezieren, um die rechte Halsschlagader freizulegen. Die Karotisscheide ist die fibröse Schicht, die die gemeinsame Halsschlagader, die Vene und den Vagusnerv bedeckt, und dieses Bündel kann durch die leuchtend rote gemeinsame Halsschlagader sichtbar gemacht werden.
Reinigen Sie ein Segment der Arteria carotis caudal zur Karotisbifurkation der umgebenden Faszie und trennen Sie es vom Vagusnerv und den Venen. Isolieren und reinigen Sie die Karotisbifurkation von den umgebenden Nerven und Faszien. Positionieren Sie die feine Pinzette unter der äußeren Halsschlagader und führen Sie eine 5-0-Seidennaht unter die Arterie.
Knoten und straffen Sie die Naht und schneiden Sie überschüssige Linie. Positionieren Sie die feine Pinzette unter der Arteria carotis communis und führen Sie eine 5-0-Seidennaht unter die Arterie. Binden Sie einen Knoten und ziehen Sie die Naht an einer Position in der Nähe der vorgeschlagenen Injektionsstelle fest.
Schneiden Sie die überschüssige Naht ab und lassen Sie etwa 10 Millimeter der Linie übrig. Schneiden und befeuchten Sie einen Streifen flusenarmer Einwegwischer etwa 10 x 5 Millimeter. Falten Sie den Streifen und legen Sie ihn unter die Halsschlagader an der vorgeschlagenen Injektionsstelle.
Dies stützt das Gefäß während der Injektion. Legen Sie auf der gemeinsamen Halsschlagader rostral zur vorgeschlagenen Injektionsstelle eine dritte Ligatur mit einem losen Knoten. Dies wird erst nach der Injektion gestrafft.
Rühren Sie die Zellsuspension vorsichtig und ziehen Sie 200 Mikroliter Zellsuspension mit einer 31-Gauge-Nadel in eine Insulinspritze. Legen Sie die Spritze in den Spritzentreiber, der mit einem aktivierenden Fußpedal verbunden ist. Befestigen Sie eine feine Kanüle mit einer 31-Gauge-Nadel an der Spritze und bereiten Sie die Leine vor.
Überprüfen Sie, ob die Halsschlagader gut positioniert und unter Druck steht. Mit zwei feinwinkligen Pinzetten, von denen eine sanft auf das Ende der ersten Ligatur gespannt wird und die andere die 31-Gauge-Nadel hält, führen Sie die Nadel mit der Abschrägung langsam in das Lumen des Blutgefäßes ein und achten Sie darauf, sie nicht zu punktieren. Injizieren Sie langsam 100 Mikroliter zuvor vorbereitete Zellsuspension mit 10 Mikrolitern pro Sekunde in die gemeinsame Halsschlagader.
Dies wird 2,5 mal 10 an die fünften Zellen in das Blutgefäß liefern. Eine erfolgreiche Injektion kann durch die Reinigung von Blut aus dem Halsschlagadergefäß visualisiert werden. Heben und straffen Sie die lockere Ligatur sofort nach dem Ziehen der Nadel vorsichtig, um Rückfluss und Blutungen zu vermeiden.
Schneiden Sie überschüssige Nähte ab und entfernen Sie das Stück angefeuchteter Einwegwischer mit geringem Fussel. Spülen Sie den Operationshohlraum mit einer P-200-Pipette zweimal mit 150 bis 200 Mikrolitern sterilem Wasser oder Kochsalzlösung aus. Nach der Überprüfung auf Blutungen positionieren Sie das Weichgewebe, die Speicheldrüsen und die Haut über der Halsschlagader und der Luftröhre.
Verschließen Sie die Hautschicht des Einschnitts mit einem Nahtnadelhalter, einer Pinzette und einer resorbierbaren oder nicht resorbierbaren 6-0-Monofilamentnaht in einem kontinuierlichen Muster. Injizieren Sie 50 Mikrogramm pro Kilogramm Buprenorphin und ein Milligramm pro Kilogramm Meloxicam durch subkutane Injektion als postoperative Schmerzlinderung. Bringen Sie das Tier in einen warmen und sauberen Käfig, um sich von der Narkose zu erholen.
Lektin wurde in die gemeinsame Halsschlagader der Mäuse mit oder ohne externe Ligerie der Halsschlagader injiziert. Eine Reduktion des Lektins wurde im Wangengewebe beobachtet, wenn die äußere Halsschlagader ligiert war. Die Ergebnisse zeigten, dass die Ligatur keinen Einfluss auf die Gehirnabgabe hatte.
Die Tumorprogression wurde mit Hilfe der Luciferase-exprimierenden, HER2-amplifizierten Brustkrebszelllinie überwacht. Das BT474-Hirnmetastasenmodell zeigte einen Anstieg der biolumineszierenden Signale ab der fünften Woche nach der internen Karotisinjektion und wuchs danach progressiv. Von Woche fünf bis acht deutete die heterogene Signalintensität auf einen intrakraniellen Tumor mit komplexer Flüssigkeitsperfusion hin.
Die Gadoliniumkonzentration innerhalb der Tumorregion nahm zu, als sie aus dem Blutkreislauf in das Tumorgewebe austrat. Die Anhäufung von Nanomedizin und Hirnmetastasen wurde bei den BT-474-Mäusen durch höhere Nanomedizinspiegel bestätigt, die in der Tumorregion im Vergleich zu den unbeteiligten Hirnregionen nachgewiesen wurden. Als das BT-474-Hirnmetastasenmodell voranschritt, begannen die Tiere bis zu 20% Körpergewicht zu verlieren, so dass die mediane Überlebenszeit neun Wochen nach der Injektion betrug.
Die histologischen Ergebnisse zeigten, dass die Tumoren einseitig lokalisiert wurden und mit der Stelle der Karotisinjektion übereinstimmten, wo die Tumoren meist als feste, solitäre Massen auftraten. Taschen mit leeren Räumen wurden häufig beobachtet und bestanden aus nekrotischen Zellen, während bei einigen Tieren auch kleinere Auswüchse vorhanden waren. Das Wichtigste, woran Sie sich beim Versuch des Protokolls erinnern sollten, ist, die Halsschlagader vor dem Einführen der Nadel richtig vorzubereiten und zu positionieren und dann während des Einführens der Nadel die richtige Spannung anzuwenden.
Dieses Modell ist nützlich für Forscher, die die Medikamentenabgabe an das Gehirn und die Wirksamkeit der neuen Therapeutika zur Behandlung von Hirnmetastasen untersuchen.
