Dieses Protokoll schlug ein Modell der Epilepsie mit Amygdala als Ursprung vor. Es ebnet den Weg zur Untersuchung mesialer Temporallappenstrukturen. Dieses Modell könnte als Grundlage des Experiments interpretiert werden.
Da es sich bei diesem Protokoll um eine kostengünstige und effiziente Methode handelt, kann es in den meisten Labors schnell durchgeführt werden. Das Verfahren wird von Yongchang Lu, einem Doktoranden in unserem Labor, demonstriert. Beginnen Sie mit dem Sammeln der vorbereiteten Komponenten, beginnend mit zwei Zentimeter langen Stücken teflonbeschichteten Wolframdrahts mit einem Bärendurchmesser von 76,2 Mikrometern.
Ein Stück Silberdraht mit einem Bärendurchmesser von 127 Mikrometern gleicher Länge und ein Satz von zwei mal zwei gemessenen Seilstiften. Verwenden Sie ein Feuerzeug, um ein Ende jedes Wolframdrahtes zu verbrennen, um fünf Millimeter der Isolierbeschichtung zu entfernen. Schälen Sie einen Abschnitt des ultrafeinen mehradrigen Drahtes.
Wickeln Sie es von unten nach oben aus, wo es dunkel wird und sich nach oben fortsetzt. Kombinieren Sie diesen superfeinen Draht und den Wolframdraht, indem Sie ein Ende einklemmen und das andere vorsichtig verdrehen, sodass die beiden Materialien leicht miteinander verflochten werden können. Ziehen Sie vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Drähte fest umwickelt sind, und schneiden Sie den überschüssigen superfeinen Draht ab.
Versuchen Sie, den Wolframdraht während des gesamten Vorgangs gerade zu halten. Befestigen Sie den Seilstift an der Klemme am Schweißtisch, wobei die längere Seite der Stifte nach außen zeigt. Nehmen Sie mit der Spritzennadel etwas Lötpaste auf und tragen Sie sie auf die Stifte auf.
Erhitzen Sie den Schweißbrenner auf 320 Grad Celsius. Schmelzen und bestreichen Sie bleifreien Zinndraht mit der Brennerspitze. Überlappen Sie das obere Ende des Wolframdrahtes mit einer Nadel der Seilstifte und verwenden Sie das Lot am Brenner, um den Wolframdraht mit dem Stift zu verbinden.
Schweißen Sie einen weiteren Wolframdraht und einen weiteren Silberdraht auf die gleiche Weise an den Seilstift, so dass jeder Draht einer Nadel entspricht. Schneiden Sie zwei Schrumpfschläuche etwas länger als das obere Ende des Wolframdrahtes. Legen Sie sie auf die Lötstelle von zwei Wolframdrähten und stellen Sie sicher, dass der leitende Teil vollständig in der Röhre bedeckt ist, so dass der Stromkreis der beiden Wolframdrähte nicht in Reihe geschaltet wird.
Entfernen Sie die Elektrode von der Schweißtischklemme und halten Sie die Elektrode vorsichtig mit einer großen Zange fest, da die Elektroden beim Erhitzen des Schrumpfschlauchs leicht ihre Form verlieren können. Verwenden Sie eine gute Wärmeleitfähigkeitsklemme mit etwas mehr Kraft. Schalten Sie den Luftkanal ein und heizen Sie, bis eine Temperatur von 320 Grad Celsius erreicht ist.
Blasen Sie den Schrumpfschlauch einige Sekunden lang auf, bis er festgezogen ist. Verstärken Sie die Elektrode mit Schmelzklebstoff. Halten Sie die beiden Wolframdrähte fest und verdrehen Sie sie zusammen, wobei Sie ihre Enden auseinander halten.
Kürzen Sie die verdrillten Wolframdrähte auf eine Länge von etwa 10 Millimetern, so dass der Abstand an den Enden 0,5 Millimeter nicht überschreitet. Überprüfen Sie die Elektroden mit einem Multimeter, indem Sie einen Stab des Multimeters auf die ungeschweißte Seite der Seilstifte legen und das Ende des Wolframdrahts oder Silberdrahtes vorsichtig mit dem anderen Stab berühren. Überprüfen, ob der Stromkreis glatt ist.
Stellen Sie sicher, dass die Linien nicht in Reihe geschaltet sind. Ziehen Sie an jedem Ende fünf Millimeter der Isolierhaut ab, um den Metalldraht im Inneren freizulegen. Fügen Sie jedem Starterdraht einen Abschnitt Schrumpfschlauch hinzu.
Schweißen Sie jeden Draht mit dem Anschlussstecker des EEG-Geräts. Schrumpfen Sie den Schrumpfschlauch mit heißer Luft. Fügen Sie jedem Rotordraht ein Stück Schrumpfschlauch hinzu.
Schrauben Sie die leitenden Teile der roten und orangefarbenen Drähte zusammen und schweißen Sie sie an eine Verbindung und den Header, um den Seilstift zu passen. Schweißen Sie die anderen beiden Drähte am Header an jede Verbindung. Wiegen Sie die Maus.
Wenn die Maus vollständig betäubt ist, rasieren Sie die Haare vom Auge bis zum Ohrbereich mit einem Rasierer. Befestigen Sie die Maus auf dem stereotaktischen Rahmen. Setzen Sie die vorderen oberen Zähne in den Schneidezahn ein und führen Sie beide Ohrstangen in gleicher Tiefe in die Ohren ein.
Tragen Sie Erythromycin-Augensalbe auf die Augen auf, um Trockenheit und Blindheit durch helles Licht während der Operation zu verhindern. Desinfizieren Sie den Operationsbereich mindestens dreimal mit abwechselnden Tupfern von Jodophor und 75% Alkohol. Machen Sie einen Längsschnitt, um den Operationsbereich vollständig freizulegen, oder machen Sie einen dreieckigen Schnitt, solange er die vorderen und hinteren Fontanellen und Elektrodenimplantationsstellen freilegt.
Rollen Sie ein kleines Stück Baumwolle zu einem Knäuel und befeuchten Sie es mit 3% Wasserstoffperoxid. Entfernen Sie das am Schädel befestigte Weichgewebe, indem Sie den exponierten Bereich vorsichtig mit einem kleinen Wattebausch reiben, bis die vordere und hintere Fontanelle zu sehen sind. Stellen Sie die vordere und hintere Höhe so ein, dass die vordere und hintere Fontanelle horizontal ist.
Betrachten Sie die Position der vorderen Fontanelle als Ursprung der Achsen. Befestigen Sie eine Edelstahlschraube am linken Kleinhirnschädel. Stellen Sie die Koordinaten für das Amygdala-Anzünden aus dem Bregma ein und stellen Sie das stereotaktische Gerät ein, um diesen Punkt zu lokalisieren und zu markieren.
Bohren Sie mit einem Schädelbohrer mit einem Durchmesser von 0,5 Millimetern ein Loch in den Marschpunkt. Befestigen Sie die Elektroden an der Aufnahmestange des stereotaktischen Geräts. Platzieren Sie die Elektrode senkrecht über dem Loch und senken Sie die Position langsam auf minus 4,9 Millimeter.
Wickeln Sie den Silberdraht dreimal um die Schraube. Achten Sie darauf, den Elektrodenkörper während des Betriebs nicht zu schütteln. Mischen Sie Zahnzement und tragen Sie ihn vorsichtig auf die Elektroden- und Schädeloberfläche auf.
Wenn der Zahnzement aushärtet, modifizieren Sie die Außenseite, bis sich der Zement, der die feste Elektrode umschließt, in einen Kegel verwandelt. Lassen Sie dann die Elektrode vom stereotaktischen Gerät los. Nehmen Sie die Maus heraus und legen Sie sie wieder in den Käfig.
Halten Sie es von den anderen Mäusen getrennt. Legen Sie die Maus in eine maßgeschneiderte Box mit Slipperkabeln, die die Elektrode am Mauskopf und das EEG-Gerät verbinden. Führen Sie das Kabel durch ein Loch im Deckel der Box und stellen Sie die in der Box verbleibende Länge so ein, dass sich die Maus frei bewegen kann.
Schalten Sie das EEG-Gerät ein und stellen Sie sicher, dass es ordnungsgemäß funktioniert. Stellen Sie die Stimulatorparameter so ein, dass monophasische Rechteckwellenimpulse von einer Millisekunde bei 60 Hertz für eine Zugdauer von einer Sekunde für 10 Stimulationszyklen abgegeben werden. Beginnen Sie mit einer Stromstärke von 50 Mikroampere für die erste Stimulation.
Überwachen Sie das EEG nach der Entladung, die durch hochfrequente Spitzen gekennzeichnet ist. Wenn keine Entladung beobachtet wird, fügen Sie dem nächsten Stimulus 25 Mikroampere hinzu und setzen Sie diesen Vorgang alle 10 Minuten fort, bis eine Nachentladung beobachtet wird und fünf Sekunden dauert. Stimulieren Sie die Maus alle 15 Minuten, nicht mehr als 20 Mal am Tag, mit der festgelegten Stromstärke.
Überwachen Sie die Verhaltensreaktionen auf den Reiz. Die Elektrodenimplantation wurde an sechs gesunden erwachsenen männlichen C57 schwarz 6 Mäusen durchgeführt und die elektrische Stimulation wurde zwei Wochen nach der Operation durchgeführt. Das Ausmaß der Verhaltensanfälle nahm allmählich mit zunehmender Anzahl der Reize zu und die Anzahl der Reize, die für das vollständige Anzünden erforderlich waren, wurde aufgezeichnet.
Das EEG nach der Entladung dauerte fünf bis 15 Sekunden. Dann verstärkten sich die intrakraniellen Spontanentladungen und Verhaltenssymptome begannen. Die Anfallsdauer betrug in der Regel weniger als eine Minute, was das Risiko des Todes durch schwere Krämpfe, die zu Apnoe führten, verringert.
Die Expression von c-Fos im Hirngewebe wurde zwei Stunden nach dem vollständigen Anzünden immunhistochemisch nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Expression von c-Fos in der ipsilateralen Amygdala signifikant zugenommen hat, was die Machbarkeit dieses Modells bestätigt. Die Trennung der Wolframdrahtenden sollte einen halben Millimeter nicht überschreiten, da sie sonst nicht durch das Gehirnloch gelangen.
Die Länge der Elektrode sollte nicht zu lang sein, da sie sonst die Aktivität der Mäuse beeinträchtigt.
