Dies ist ein Hirntumor-Resektionsparadigma, das in der präklinischen Forschung zu Therapeutika für Hirntumore dringend benötigt wird. Es ermöglicht eine standardisierte Resektion durch einen minimal-invasiven Ansatz und ist gleichzeitig an ein automatisiertes Gewebekonservierungssystem gekoppelt. Dieses Protokoll ermöglicht es dem Tier, nach der Operation zu überleben und hilft so, die Veränderungen des Krankheitszustands nach der Therapie bei demselben Tier zu verstehen.
Dies hilft bei sequentiellen und zeitraffertherapeutischen Anwendungen. Mit dieser Technik können wir die Biologie der Krankheit bewerten und ein mögliches späteres Management planen. Dies hat erhebliche Auswirkungen und Chancen auf die Wirkstoffforschung und neuartige Therapeutika.
Die Konzepte der standardisierten Resektion, eines minimal-invasiven Ansatzes und der automatisierten Gewebekonservierung können auf andere Tumorarten in verschiedenen Organsystemen wie Lebertumoren und Kopf- und Halskrebs ausgeweitet werden. Das Protokoll ist einfach und das System ist benutzerfreundlich. Lesen Sie am besten das veröffentlichte Protokoll, das alle notwendigen Schritte und Fehlerbehebungen enthält.
Beginnen Sie das Experiment, indem Sie die Maus auf Sedierung untersuchen, indem Sie den Zeh kneifen. Tragen Sie Augensalbe auf die Augen auf, um Trockenheit der Hornhaut zu vermeiden. Platzieren Sie dann die Maus auf einem stereotaktischen Rahmen.
Entfernen Sie die Klammer aus der vorherigen Operation und desinfizieren Sie die Haut mit abwechselnden Zyklen eines Peelings auf Chlorhexidin- oder Betainbasis und Alkohol. Erstellen Sie dann mit einem sterilen Skalpell einen um einen Zentimeter langen Mittellinienschnitt entlang der vorherigen Operationsnarbe. Befestigen Sie das MIRS-Handstück über den Bühnenadapter am stereotaktischen Arm.
Um das MIRS-Gerät einzurichten, stecken Sie das Netzkabel auf der Rückseite in die Netzkabelbuchse. Schalten Sie das System ein oder aus, indem Sie zwischen Null und Eins umschalten. Stecken Sie ein Ende des Stickstoffschlauchs in die männliche Armatur auf der Rückseite der Konsole.
Drehen Sie die Verbindungsmutter im Uhrzeigersinn, um sie festzuziehen. Stellen Sie sicher, dass der Versorgungsdruck 100 PSIG nicht überschreitet und befestigen Sie den Schlauch an der Stickstoffzufuhr. Verschließen Sie den Deckel des Vakuumanschlusses, um ein Auslaufen zu vermeiden.
Überprüfen Sie, ob der Aspirationsknopf an der Vorderseite der Konsole auf 100 eingestellt ist, dass keine Leckage im Absaugsystem vorliegt und ob der Stickstoffeingangsversorgungsdruck korrekt ist. Stecken Sie den grauen Fußpedalanschluss in die graue Buchse, bis er einrastet. Stecken Sie auf die gleiche Weise den blauen Handstückverbinder in die blaue Buchse.
Grundieren Sie jedes Handstück, indem Sie sterile Flüssigkeit durch den Schlauch und das Handstück in die Öffnung und dann in den Kanister einsaugen, um sicherzustellen, dass das Innere des Schlauchs und des Handstücks geschmiert ist. Wählen Sie den Modus für die Aspiration auf der Konsolenvorderseite und initiieren Sie ihn mit dem Fußpedal. Führen Sie die 23-G MIRS-Kanüle bis zu einer Tiefe von 2,5 Millimetern in das Gratloch ein.
Leiten Sie den Resektionsprozess ein, indem Sie das Fußpedal drücken, das mit der Kanüle verbunden ist. Führen Sie vollständige Resektionszyklen mit dem Bedienknopf im Handstück durch. Ziehen Sie nach dem Resektionsprozess die 23-Gauge-MIRS-Kanüle heraus und fügen Sie fünf Milliliter 1X PBS hinzu, um den Schlauch zu spülen und Restablagerungen zu entfernen.
Schließen Sie dann die Wunde mit einem Hefter und entfernen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Rahmen. Bringen Sie die Maus zum Heizkissen zurück, um sich von der Narkose zu erholen, bevor Sie sie wieder in den Käfig legen. Nach dem Experiment reinigen Sie die Kanüle mit gekühlten Medien und Luft, um das gesamte resezierte Gewebe zurück in den Sammelbehälter zu drücken.
Entfernen Sie den Sammelbehälter aus dem System, und setzen Sie eine Kappe auf. Als nächstes legen Sie die distale Spitze der Kanüle in 3% Wasserstoffperoxid und saugen Sie, um die Saugleitung zurück zum Saugsammelbehälter zu füllen. Lassen Sie es 60 bis 90 Sekunden stehen und pulsieren Sie intermittierend Luft und Medien, um es zu spülen.
Tauchen Sie die Tumorprobe für fünf Minuten bei Raumtemperatur in eine Gewebekulturschale, die RBC-Lysemedium enthält. Legen Sie dann einen 70-Mikron-Filter auf ein 50-Milliliter-konisches Röhrchen und verwenden Sie einen Spritzenkolben, um die Tumorprobe durch den Filter zu leiten. Verwenden Sie mit einer Transferpipette das RPMI 1640-Medium, um die Zellen und die Gewebemasse durch den Filter zu leiten.
Zentrifugieren bei 428 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie jede Probe in fünf Milliliter des vorbereiteten RPMI 1640-Mediums. Legen Sie die Proben für 20 Minuten bei 200 U/min bei 37 Grad Celsius in einen Shaker-Inkubator.
Nach der Inkubation die Proben bei 428 mal G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Einzelne Zellen durch ein 70-Mikron-Zellsieb filtern und bei 274 mal G drei Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Führen Sie eine Zelllebensfähigkeitsanalyse mit Trypanblau und einem Hämozytometer durch.
Die chirurgische Resektion bei Mäusen mit MIRS verursachte eine signifikante Abnahme der Tumorlast, wie die Verringerung des mittleren Biolumineszenzsignals für Gruppen mit großer und kleiner Tumorlast zeigt. Im Vergleich zu den MRT-Bildern von Tumoren vor der Resektion kann die Resektionshöhle auf den Postresektionsscans als großer, runder hypointensiver Bereich an der Tumorimpfstelle identifiziert werden. In H & E-gefärbten Schnitten wurde eine klare kreisförmige Resektionshöhle mit einem Rand von Blutprodukten, Entzündungen und Resttumorzellen beobachtet.
Das Resektionsvolumen nahm signifikant zu, wenn zwei Umdrehungen der Schnittöffnung durchgeführt wurden, was eine Optimierung des Resektionsvolumens je nach Tumorlast ermöglichte. Der Vergleich des Überlebens bei Mäusen mit unbehandelten Tumoren mit Mäusen, die sich einer Resektion von Tumoren durch MIRS unterzogen, zeigte eine Erhöhung des Überlebens von 16 auf 22 Tage in der kleinen Tumorgruppe. In ähnlicher Weise erhöhte sich in der Gruppe mit einer größeren Tumorlast das mediane Überleben von 12 auf 19 Tage.
Lichtmikroskopische Bilder der Proben, die aus dem Gewebekonservierungssystem entnommen wurden, erschienen als einzelne Zellen mit der Anwesenheit einiger kleiner Gewebestücke am Tag Null. Nach sieben Tagen zeigten die mit MIRS geernteten Zellen Neurosphärenbildung in Suspensionskulturen, die ihr Tumorinitiationspotenzial anzeigten. Es ist wichtig, das Schlauchsystem direkt nach dem Eingriff zu reinigen und zu spülen, um eine Verstopfung des Systems zu vermeiden.
Im Anschluss an dieses Verfahren können Wirksamkeitsstudien von Therapeutika und Studien zu diagnostischen und prognostischen Markern an überlebenden Tieren nach chirurgischer Resektion mit dem minimal-invasiven Resektionssystem durchgeführt werden.
