Ziel dieser Methode ist es, Mutanten im photorespiratorischen Pfad mittels eines CO2-armen Screenings zu identifizieren. Wir stellen eine Methode vor, um Mutanten zu identifizieren, die die Photorespiration nach Exposition gegenüber niedrigem CO2 stören. Ein Vorteil dieser Methode ist, dass es sich um ein Hochdurchsatz-Screening für Sämlinge handelt, das in relativ kurzer Zeit durchgeführt werden kann.
Die folgenden Abschnitte enthalten Details zur Saatgutvorbereitung und -sterilisation, zum Pflanzenwachstum und zur CO2-armen Behandlung, zur Konfiguration des Fluoreszenzbildgebungssystems, zur Messung der Quantenausbeute behandelter Proben, zu repräsentativen Ergebnissen und Schlussfolgerungen. Saatgutaufbereitung und Sterilisation. Die Saatgutaufbereitung besteht aus Saatgutaufnahme und Saatgutsterilisation.
Es ist wichtig zu beachten, dass alle diese Schritte in einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden, um sterile Bedingungen zu erhalten. Alle notwendigen Materialien, Reagenzien und Wachstumsmedien werden autoklaviert. Die verwendeten Samenlinien sind plgg1-1, abcb26 und WT oder Wildtyp.
Samen in sterilem Wasser in einer Laminar-Flow-Haube aufsaugen und dann zwei Tage lang bei vier Grad Celsius im Dunkeln schichten. Unter sterilen Bedingungen 10 Milliliter 50% Volumen-zu-Volumen-Bleichlösung vorbereiten und etwa 20 Mikroliter Tween 20 hinzufügen. Entfernen Sie Wasser aus den aufgenommenen Samen, geben Sie dann einen Milliliter Bleichlösung in das Mikrozentrifugenröhrchen und inkubieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur.
Entfernen Sie die Bleichlösung mit einer Pipette. Spülen Sie die Samen in einem Milliliter sterilem Wasser ab, um sie zu resuspendieren. Entfernen Sie das Wasser, sobald sich die Samen auf dem Boden abgesetzt haben.
Samen in steriler 0,1%iger Agaroselösung resuspendieren. Zur Saatgutbeschichtung Basalmediumplatten mit 1%MS-Medium mit Vitaminen und 1%Agar zur Kultivierung der Testmutanten. Schneiden Sie eine 200 Mikroliter große Pipettenspitze mit einer Rasierklinge ab.
Legen Sie mit einer Pipette einen Samen in die Mitte des dafür vorgesehenen quadratischen Gitters für jede Testmutante oder jeden Genotyp. Hier kommt eine quadratische Platte mit einem Raster von einem mal einem Zentimeter zum Einsatz. Dies hilft, einen gleichmäßigen Abstand zwischen den einzelnen Sämlingen einzuhalten und Überlappungen zu vermeiden, was später in der Fluoreszenzbildgebung und -analyse wichtig sein wird.
Sobald die Samen beschichtet sind, wickeln Sie chirurgisches Klebeband um den Deckel, um es zu versiegeln, und legen Sie es dann in die Wachstumskammer. Pflanzenwachstum und CO2-arme Behandlung. Züchten Sie Pflanzen für sieben bis neun Tage bei 20 Grad Celsius unter einem achtstündigen Lichtzyklus von 120 Mikromol pro Quadratmeter pro Sekunde und 16 Stunden Dunkelheit bei 18 Grad Celsius.
Überprüfen Sie die Pflanzen am sechsten Tag, um festzustellen, ob sie groß genug für die Bildgebung sind. Am achten Tag nach der Beschichtung die Pflanzen einem niedrigen CO2-Gehalt aussetzen. Stellen Sie die Kläranlagen 12 Stunden lang in eine versiegelte Box innerhalb der Wachstumskammer mit einer Lichtintensität von 200 Mikromol pro Quadratmeter und Sekunde.
Der CO2-arme Zustand wurde mit einem luftdichten transparenten Behälter mit 100 Gramm Kalknatron, der im Boden des Behälters platziert wurde, konstruiert. Der Behälter wurde in derselben Wachstumskammer wie die Steuerung platziert. Die Kontrollanlagen bleiben 12 Stunden lang unter 120 Mikromol pro Quadratmeter und Sekunde im Umgebungs-CO2.
Konfigurieren Sie das Fluoreszenzbildgebungssystem. Platzieren Sie eine Testplatte zentriert unter der Kamera in einem festen Abstand im Fluoreszenzbildgebungssystem. Navigieren Sie in der Gerätesoftware zum Live-Fenster und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Blitze, um nicht-aktinische Messblitze einzuschalten.
Klicken Sie auf die Zoom- und Fokuswerkzeuge, bis Sie ein vollständiges und scharfes Bild sehen. Stellen Sie den Wert des EL-Verschlusses auf Null ein und passen Sie die Empfindlichkeit an, um ein Fluoreszenzsignal im Bereich von 200 bis 500 digitalen Einheiten zu erhalten. Stellen Sie einen Belichtungsmesser in die gleiche Position, die zum Anpassen der Kameraeinstellungen verwendet wurde.
Aktivieren Sie im Live-Fenster das Kontrollkästchen Super, um einen Sättigungsimpuls zu starten, der 800 Millisekunden anhält. Verwenden Sie den Schieberegler, um den Prozentsatz der relativen Leistung für den Superpuls anzupassen, bis der Belichtungsmesser 6.000 bis 8.000 Mikromol pro Quadratmeter und Sekunde anzeigt. Messung der Quantenausbeute behandelter Proben.
Direkt nach der Behandlung decken Sie die Platten mit Aluminiumfolie für 15 Minuten zur dunklen Anpassung ab. Entfernen Sie die Folie, um die Quantenausbeute von Photosystem zwei mit einem pulsamplitudenmodifizierten Fluorometer zu messen. Platzieren Sie dann die Keimlingsplatte direkt unter der Kamera und führen Sie das Quantenausbeuteprotokoll aus, das Sie in unserem GitHub-Repository finden.
Laden Sie das Quantum Yield Protocol von GitHub herunter. Verwenden Sie eine Fluorometer-Software, um die Programmdatei zu öffnen, indem Sie auf das Ordnersymbol klicken und zum Dateispeicherort navigieren. Führen Sie das Quantenausbeuteprotokoll aus, indem Sie auf das rote Blitzsymbol klicken.
Navigieren Sie nach Abschluss des Protokolls zum Voranalysefenster. Unterteilen Sie die Platte in einzelne Sämlinge, indem Sie alle Pixel für jeden Sämling auf dem Plattenbild hervorheben. Klicken Sie auf Hintergrundausschluss, um alle hervorgehobenen Hintergrundpixel zu entfernen, sodass nur der Sämlingsbereich übrig bleibt.
Klicken Sie auf Analysieren, um Fluoreszenzdaten für jeden Sämling auf dem Plattenbild zu generieren. Stellen Sie den Fluoreszenzwertbereich manuell ein, um konsistente Minimal- und Maximalwerte für alle Platten anzuzeigen. Klicken Sie auf der Registerkarte Experiment auf Exportieren und dann auf Numerisch.
Klicken Sie auf Numerischer Durchschnitt, um eine Textdatei zu generieren, die die Quantenausbeute für jeden Sämling enthält. Öffnen Sie die Textdatei und die Tabelle zur Analyse. Die Tabelle enthält die Bereichsnummer, die Größe der Pixel, Fm, Ft, Fq und QY. Zuerst müssen wir die Gebietsnummer zu ihrem entsprechenden Genotyp identifizieren, ob Wildtyp oder Testmutante, Ergebnisse.
Hier sind die Plattenbilder von Roh- und Fluoreszenzbildern aus dem Umgebungs- und CO2-armen Screening von Wildtypen und Testmutanten. Jede Platte ist mit einer Flächenzahl mit entsprechenden Fluoreszenzwerten als Quantenausbeute oder QY gekennzeichnet. Die Daten werden als Textdatei exportiert und können zur Analyse in einer Tabelle geöffnet werden. Die dunkel angepassten Fv/Fm-Quantenertragseffizienzen von Wildtypen und Mutanten werden durch Box- und Whisker-Plots visualisiert.
Um den statistischen Unterschied von Wildtypen und Testmutanten zu testen, wurde ein paarweiser T-Test mit einem P-Wert von weniger als 0,05 verwendet. Hier verwenden wir die photorespiratorische Mutantenlinie mit reduzierter Quantenausbeute Fv/Fm als Testmutante, um die Effizienz unserer Screening-Methode zu überprüfen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Testmutanten im Vergleich zu den Wildtypen eine signifikant geringere Quantenertragseffizienz aufweisen.
Dies deutet darauf hin, dass unsere Screening-Methode in der Lage ist, photorespiratorische Mutanten mittels CO2-armem Screening zu identifizieren. Schlüsse. Eine wichtige Sache, an die Sie sich bei der Verwendung dieses Protokolls erinnern sollten, ist sicherzustellen, dass Arabidopsis-Sämlinge groß genug sind, um die Fluoreszenz zu messen, aber nicht so groß, dass sich die Pflanzen während der Bildgebung überlappen würden. Es wird bevorzugt, die Sämlinge als die ersten echten Blätter darzustellen, um zu versuchen, die Blattgröße und die Blattwinkel einheitlich zu halten.
Dieses Protokoll kann als Hochdurchsatz-Screening für Sämlinge verwendet werden. Die Abbildung jeder Platte ist relativ schnell und hat das Potenzial, weit über 1.000 Sämlinge pro Tag zu screenen. Die Chlorophyllfluoreszenzanalyse ermöglichte es uns, photorespiratorische Mutanten mit einem CO2-armen Screening zu identifizieren, was für die Aufrechterhaltung der Photorespirationseffizienz wichtig ist.
Dieses Protokoll ist nicht auf Arabidopsis beschränkt und hat die potenzielle Verwendung für abiotische Stressreaktionsexperimente.
