Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen bei der Therapie von microRNA an der Niere zu beantworten, die nach wie vor eine Herausforderung darstellt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Therapie von microRNA-Nachahmungen der Niere ermöglicht, ohne eine Interferonantwort oder genetische Instabilität zu verursachen. Lösen Sie zunächst 10 Mikroliter PEI-NPs in 90 Mikrolitern 5%iger Glukoselösung in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen auf.
Wirbeln Sie dann die Röhre vorsichtig und drehen Sie sie nach unten. Mischen Sie 50 Mikroliter künstlich synthetisierte miRNAs, gelöst in 100 Mikromolar nukleasefreiem Wasser, mit 50 Mikromolar 10%iger Glukoselösung in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Wirbeln Sie das Rohr vorsichtig vor und drehen Sie es nach unten.
Bei diesem Prozess wird miRNA in 5%iger Glukoselösung gelöst. Mischen Sie dann 100 Mikroliter PEI-NPs in 5%iger Glukoselösung und 100 Mikroliter miRNA-Mimic in 5%iger Glukoselösung. Wirbeln Sie das Rohr vorsichtig vor und drehen Sie es nach unten.
Inkubieren Sie die Mischung 15 Minuten lang bei Raumtemperatur, um einen stabilen Komplex von PEI-NPs miRNA-Nachahmung herzustellen. Lösen Sie zwei Mikroliter PEI-NPs in 98 Mikrolitern 10%iger Glukoselösung in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen auf. Wirbeln Sie das Rohr vorsichtig vor und drehen Sie es nach unten.
Geben Sie dann 100 Mikroliter Cy3-markierte miRNA-Nachahmung zu 100 Mikrolitern PEI-NPs in 10%iger Glukoselösung hinzu und wirbeln Sie das Röhrchen sanft vor. Inkubieren Sie die Mischung 15 Minuten lang bei Raumtemperatur, um einen stabilen Komplex aus PEI-NPs-Cy3-markierter miRNA-Nachahmung herzustellen. Legen Sie die UUO-Maus ohne Betäubung kopfüber in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und stecken Sie dann den Schwanz durch ein vorbereitetes Loch in der Kappe.
Füllen Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer 30-Gauge-Nadel mit 200 Mikrolitern PEI-NPs-Cy3-markiertem miRNA-Mimic-Komplex und injizieren Sie den Komplex über die Schwanzvene der Maus. Machen Sie als Nächstes mit einer chirurgischen Schere und einer Pinzette einen Schnitt in Haut, Muskeln und Rippen, um das Herz freizulegen. Nach einem Schnitt in den rechten Vorhof injizieren Sie PBS in die linke Herzkammer, bis sich die Nierenfarbe zu blassgelb ändert.
Dies deutet darauf hin, dass der gesamte Mauskörper mit PBS durchblutet ist. Nachdem Sie die Nieren entnommen haben, entfernen Sie die Nierenkapseln und waschen Sie sie zweimal mit PBS. Betten Sie die Nierengewebeproben in OCT-Verbindung ein und frieren Sie sie in flüssigem Stickstoff ein.
Verwenden Sie einen Kryostaten, um Schnitte vorzubereiten und die Schnitte auf silanbeschichtete Objektträger zu montieren. Fixieren Sie sie mit 4% Paraformaldehyd und waschen Sie die Objektträger zweimal vorsichtig mit PBS. Visualisieren Sie abschließend die Fluoreszenzfärbung durch Fluoreszenzmikroskopie bei 100- und 400-facher Vergrößerung und geeigneter Bildgebungssoftware.
Das repräsentative Bild zeigt die Struktur des PEI-NPs-miRNA-Mimic-Komplexes. Die Verabreichung und Wirkung von miRNA-146a-5p-Mimik unter Verwendung von PEI-NPs bei Nierenfibrose sind in diesen Bildern dargestellt. Fluoreszenzmikroskopische Analysen zeigten, dass die Schwanzveneninjektion von PEI-NPs die miRNA-Nachahmung in den tubulointerstitiellen Raum abgeben kann.
Bei Nierenfibrose-Mäusen, die durch UUO produziert wurden, gehörten dazu renale Tubuluszellen, die keine regelmäßige Form in der Niere und im Glomerulus haben. Die qRT-PCR-Analyse zeigte, dass die Injektion von PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic eine signifikante Überexpression von miRNA-146a-5p in der Niere induzierte. Die histologische Analyse mit Sirius-Rotfärbung ist hier dargestellt.
Fluoreszenzmikroskopische Analysen zeigten, dass die Schwanzveneninjektion von PEI-NPs miRNA-Mimik in den Glomerulus und den tubulointerstitiellen Raum in Nieren von diabetischen Nierenmodellmäusen in vivo abgeben kann. Darüber hinaus zeigte die qRT-PCR-Analyse, dass die Injektion von PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic eine signifikante Überexpression von miRNA-181b-5p in der Niere induzierte. Die histologische Analyse mit periodischer Säure-Schiff-Färbung zeigte, dass die Injektion von PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic einmal pro Woche im Alter von 10 bis 20 Wochen das Fortschreiten der diabetischen Nierenerkrankung bei Mäusen hemmte.
Die Verabreichung und Wirkung von PEI-NPs-miRNA-5100-mimic in Modellmäusen mit akutem Nierenversagen, die durch Ischämie-Reperfusionsschaden erzeugt wurden, werden hier gezeigt. Die Daten der fluoreszenzmikroskopischen Analyse, der qRT-PCR-Analyse zur Bewertung der Überexpressionseffekte von miRNA-5100 nach Injektion von PEI-NPs-miRNA-5100-mimic und der histologischen Analyse der Hämatoxylin-Eosin-gefärbten Niere sind in diesen Bildern dargestellt. PEI-NPs, die zwei Tage vor dem Ischämie-Reperfusionsschaden (IRI) über die Schwanzvene injiziert werden, verhindern das Fortschreiten eines akuten Nierenversagens, das durch IRI induziert wird.
Bereiten Sie bei dieser Technik fünf Mikrometer dicke Schnitte vor, die so viel Nierengewebe wie möglich enthalten. Sie können auch sieben Mikrometer dicke Abschnitte präparieren.
