Die Bedeutung unserer Methode liegt in ihrer Fähigkeit, die Frage zu beantworten, was sind die viskoelastischen Eigenschaften von zonulären Fasern, den Fasern, die die Linse im Auge schweben? Der Hauptvorteil unserer Technik besteht darin, dass sie die viskoelastischen Eigenschaften der kleinen und empfindlichen zonulären Fasern von Mäusen mit und ohne gezielte Genmodifikationen quantifizieren kann. Mutationen in Genen, die für Mikrofibrillenproteine kodieren, liegen mehreren vererbten syndromalen Erkrankungen zugrunde.
Mit unserer Technik können wir untersuchen, wie spezifische Mutationen die biomechanischen Eigenschaften der Mikrofibrillen verändern. Um zu beginnen, nach dem Einschläfern der Maus, entfernen Sie die Augen mit einer feinen Pinzette. Führen Sie die Spitze einer Fixationsnadel durch die Augenwand und positionieren Sie sie in der Mitte des Glaskörpers, wobei sie darauf achtet, die Linse nicht zu beschädigen.
Das aufgespießte Auge vorsichtig in ein Röhrchen geben, das mit 4% Paraformaldehyd und phosphatgepufferter Kochsalzlösung gefüllt ist. Öffnen Sie das Ventil, das die Nadel mit einem fixierten Reservoir verbindet, das sich 25 Zentimeter über der Probe befindet und während der Fixierungszeit einen Überdruck von 15 bis 20 Millimeter Quecksilber im Auge aufrechterhält, und lassen Sie die Probe über Nacht fixieren. Am nächsten Tag entfernen Sie die Fixationsnadel und waschen Sie das Auge für 10 Minuten in phosphatgepufferter Kochsalzlösung.
Machen Sie mit einer ophthalmologischen chirurgischen Schere und einem Stereomikroskop einen vollständig dicken Schnitt in der Augenwand in der Nähe des Sehnervenkopfes. Verlängern Sie den Schnitt nach vorne in Richtung Äquator und dann um den Äquatorialumfang des Auges, während Sie die empfindlichen Ziliarfortsätze und die damit verbundenen zonulären Fasern vorsichtig schonen. Belichten Sie die hintere Oberfläche der Linse, indem Sie die Rückseite des Globus entfernen.
Entfernen Sie das sezierte Auge mit einer Pinzette aus der Pufferlösung und legen Sie es mit der Hornhaut nach unten auf ein trockenes Aufgabenwischen. Ziehen Sie die Hornhaut vorsichtig über die Oberfläche des Tuchs, um sie zu trocknen. Tragen Sie einen Tropfen Sofortkleber auf den Boden einer 50-Millimeter-Petrischale auf und befestigen Sie die Plattform daran.
Legen Sie die Schüssel auf die Bühnenplatte des Stereomikroskops, so dass der Brunnen mit dem Kleber in Sicht ist. Um das Auge in den Plattformschächten der Petrischale unterzubringen, fügen Sie drei Mikroliter Instantkleber hinzu. Legen Sie es vorsichtig in den Brunnen und stellen Sie es schnell so ein, dass die Rückseite des Objektivs nach oben zeigt.
Trocknen Sie die belichtete Seite der Linse, indem Sie sie vorsichtig mit der Ecke eines Trockentuchs abtupfen. Um die zonuläre viskoelastische Reaktion zu messen, schalten Sie die Skala ein, legen Sie die Petrischale auf die Waage und starten Sie dann das Skalenprotokollierungsprogramm und die Kamerasoftware. Schalten Sie den Servomotorregler ein.
Starten Sie die Controller-Anwendung am Computer und stellen Sie die Bewegungsparameter in 50-Mikrometer-Schritten ein. Erzeugen Sie eine 90-Grad-Biegung in einem Kapillarstab. Schieben Sie die gebogene Kapillare in den Kapillarsondenhalter und ziehen Sie die Sicherungsschrauben fest.
Fügen Sie zur Kapillarspitze eine kleine Perle UV-härtenden Klebstoff hinzu. Bewegen Sie die Spitze der Kapillarsonde mit den manuellen Einstellungen am Manipulator und legen Sie sie direkt über die Oberseite des Objektivs. Untersuchen Sie durch die visuelle Inspektion auf der Vorderseite und die Seitenansicht mit einer Mikroskopkamera, ob der untere Teil des UV-Klebstoffs über der Oberseite des Objektivs zentriert erscheint.
Während Sie durch die Kamera schauen, senken Sie die Sondenspitze ab, bis der UV-Kleber mit dem Objektiv in Kontakt kommt und 1/3 bis 1/2 seiner Oberseite bedeckt. Härten Sie den Kleber mit einer direktionalen, nahezu sichtbaren UV-Lichtquelle von 380 bis 400 Nanometer Wellenlänge und einer Intensität von etwa einem Milliwatt aus. PbS-Lösung in die Petrischale geben, bis das Auge bis zu einer Tiefe von mindestens zwei Millimetern bedeckt ist.
Platzieren Sie eine zylindrische Linse vor dem Mikroskop und in enger Weise an der Petrischale, ohne sie zu berühren. Starten Sie gleichzeitig die Protokollierung in einem Timer-Programm. Machen Sie mit der Kamera ein Foto vom Auge und der Sonde.
Nach 60 Sekunden beginnen Sie mit einer Verschiebung von 50 Mikrometern. Wiederholen Sie dies alle 60 Sekunden, bis das Experiment abgeschlossen ist, wie durch das Brechen aller Zonularfasern angezeigt. Speichern Sie die Skalierungsprotokollierungsdaten nach Abschluss eines Laufs und exportieren Sie sie in ein kompatibles Tabellenkalkulationsformat.
Speichern Sie auch die während des Laufs erhaltenen Objektivbilder. Importieren Sie die Daten in eine Kalkulationstabelle. Interpolieren Sie mit dem ersten und dem letzten Skalenwert die Drift im Hintergrundwert im Laufe der Zeit aufgrund der Verdunstung und subtrahieren Sie dann den interpolierten Hintergrund von der Messung in jedem Zeitpunkt.
Nach der Durchführung des Assays und der Korrektur für die Verdampfung wird die Grafik der viskoelastischen Daten invertiert. Die Größe der momentanen und entspannten Kräfte nimmt mit jedem Schritt bis zu etwa 1.000 Sekunden zu und sinkt dann, wenn die zonulären Fasern zu brechen beginnen, bis der 1.500-Sekunden-Zeitpunkt erreicht ist, an dem alle Fasern gebrochen sind. Für diese Demonstration wurde auch die viskoelastische Reaktion für Wildtyp- und MAGP-1-defiziente Mäuse verglichen.
Zum Anfangszeitpunkt von null bis 600 Sekunden ähneln sich die Graphen, was darauf hindeutet, dass die viskoelastischen Eigenschaften der zonulären Fasern nicht signifikant verändert wurden. Bei der MAGP-1 Knockout-Maus brechen die Fasern jedoch vorzeitig. Zonuläre Faserbruchkräfte wurden mit der Pull-up-Methode für MAGP-1 im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen in einem Monat und einem Jahr alten Stadien erhalten.
Die Ergebnisse zeigten, dass die Stärke der Fasern bei Wildtypmäusen mit zunehmendem Alter zunimmt. Jeder versehentliche Kontakt mit der Petrischale während dieser Schritte kann dazu führen, dass sich die Augenwand relativ zur Augenlinse verschiebt und möglicherweise die zonulären Fasern beschädigt. Dieser Pull-up-Assay hilft bei der Identifizierung von Proteinen, die zur Zugfestigkeit von Mikrofibrillen beitragen.
Wir werden diese Informationen verwenden, um realistischere Modelle des Inneren von Zonularfasern zu erstellen.
