Ziel dieses Protokolls ist es, phenolische Metaboliten im Plasma mit einer semi-zielgerichteten UPLC-MS/MS-Methode nachzuweisen. Plasmaproteine wurden mit Ethanol ausgefällt und Proben konzentriert und in der mobilen Phase vor der Injektion in die UPLC-Ausrüstung wieder suspendiert. Die Verbindungen wurden mithilfe einer semi-zielgerichteten Bibliothek identifiziert, die im Labor zusammengestellt wurde und den PCDL-Manager für Metabolomik, Software und verschiedene kostenlose Online-Datenbanken verwendete.
Wir haben eine ernährungsphysiologische Intervention mit einem Muffin- und Getränkerezept mit Brosimum alicastrum-Samenmehl durchgeführt. Am Ende der Intervention wurde der Ernährungs- und Sarkopenstatus der Teilnehmer verbessert und der Gesamtphenolgehalt des Plasmas erhöht. Aber wir müssen herausfinden, welche phenolischen Verbindungen absorbiert wurden und den positiven Effekt beigetragen haben.
Die Identifizierung und Quantifizierung der phenolischen Verbindungen, die nach dem Verzehr von Lebensmitteln, die reich an diesen Antioxidantien sind, absorbiert werden, ist eine schwierige Aufgabe, aber notwendig, wenn man die biologische Aktivität dieser sekundären Pflanzenstoffe nachweisen will. Die Bioverfügbarkeit der meisten phenolischen Komponenten ist gering, außerdem gelangen weniger als 5% von ihnen ohne strukturelle Umwandlung in Plasma. Die meisten durchlaufen mehrere Biotransformationen, wie Methylierung, Sulfonierung oder Glucuronidierung.
Eine breite Palette von Studien identifizierte die häufigsten Metaboliten in Biofluiden durch UPLC-MS und UPLC-MS/MS. Ein großer Teil des bakteriellen Metaboliten wird jedoch nicht an das Fehlen von Datenbanken gemeldet, die ihre vollständigen Informationen enthalten. Die Identifizierung von Metaboliten wird durch die Kosten und die kommerzielle Verfügbarkeit von Metabolitenstandards erschwert.
Daher kann die beste Strategie eine ungezielte oder halbzielgerichtete MS/MS-Metabolitenanalyse sein. Diese Analyse stützt sich auf die Verwendung von molekularen Merkmalsinformationen, der genauen Masse im Verhältnis von Masse zu Ladung, der genauen Masse des Monoisotopen, der Isotopenverteilung und des Fragmentierungsmusters. Bestimmung der chemischen Identität und Vergleich mit kostenlos verfügbaren Online-Datenbanken, die Polyphenolmetaboliten enthalten, die nach dem Verzehr von polyphenolreichen Diäten in Bioflüssigkeiten identifiziert wurden.
In der vorliegenden Studie haben wir eine semi-zielgerichtete UPLC-MS/MS-Methode entwickelt, um die Plasmaproben einer Gruppe älterer Menschen zu analysieren, die an einer Ernährungsintervention beteiligt sind. Lagern Sie Plasmaproben bei minus 80 Grad Celsius bis zur Analyse. Plasmaproben bei Raumtemperatur für 15 Minuten oder bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten auftauen.
Geben Sie 200 Mikroliter Plasmaprobe in ein zwei Millimeter Mikroröhrchen und mischen Sie mit 1000 Mikrolitern reinem Ethanol. Vortex-Plasmaprobe für 30 Sekunden. Zentrifugenprobe bei 6.580 Zentrifugalkraft für fünf Minuten.
Nach der Zentrifugation den Überstand mit einer Mikropipette oder Pasteurpipette sammeln und in ein neues Mikroröhrchen geben. Reservieren Sie den Überstand. Mischen Sie ein Pellet mit 1000 Mikrolitern reinem Ethanol, vertexen Sie für 30 Sekunden und zentrifugieren Sie dann unter den gleichen Bedingungen.
Sammeln Sie den Überstand und mischen Sie mit dem ersten Überstand. Entfernen Sie Ethanol aus der Probe, indem Sie reinen Stickstoff bei 135 psi verwenden. Halten Sie die Nadel einen Zentimeter von der Oberseite des Mikroröhrchens entfernt, um Probenverlust zu vermeiden, und spülen Sie, bis eine Probe trocken ist.
Trockene Proben in 100 Mikrolitern eines eins zu resuspendieren ist zu einer Mischung aus Acetonitril mit Wasser. Filtern Sie durch eine 45-Mikro-Nylon-Spritzenmembran direkt in einen HPLC-Fläschchen-Mikroeinsatz Injizieren Sie drei Mikroliter Probe auf UPLC, das mit einer C 18-Umkehrphasensäule ausgestattet ist. Stellen Sie die Temperatur des Autosamplers auf 20 Grad Celsius und den Säulenthermostat auf 25 Grad Celsius ein.
Injizieren Sie jede Probe dreifach. Verwenden Sie 0,1% Ameisensäure in Wasser als Lösungsmittel A und 100% Acetonitril als Lösungsmittel B.Stellen Sie die Durchflussrate auf 0,4 Millimeter pro Minute und ein Gradientenprogramm wie folgt ein: Null bis eine Minute 10% B, ein bis vier Minuten 30% B, vier bis sechs Minuten 38% B, sechs bis acht Minuten 60% B, acht bis 8,5 Minuten 60% B, 8,5 bis neun Minuten 10%B. Stellen Sie das Massenspektrometer in die Ionisation im negativen Modus ein.
Verwenden Sie Stickstoff als Trocknungsgas bei 300 Grad Celsius und Durchfluss bei 13 Litern pro Minute. Stellen Sie den Verneblerdruck auf 30 psi ein. Stellen Sie eine Kapillarspannung auf 4.000 Volt, eine Splitterspannung auf 175 Volt und eine Skimmerspannung auf 65 Volt ein.
Scannen Sie die Massen zwischen 100 und 1100 m/z und scannen Sie für die Massenspektrometrie Massen zwischen 50 und 1000 m/z. Stellen Sie die Datenerfassung in den Auto-MS/MS-Modus. Verwenden Sie die folgende Referenzmasse, 119,036 und 966,0007.
Suche nach phenolischen Verbindungen, phenolischen Metaboliten und anderen Verbindungen von Interesse in der wissenschaftlichen Literatur. Öffnen Sie die Datenbankverwaltungssoftware, die im UPLC-System enthalten ist. Wählen Sie Datei und dann neue zusammengesetzte Bibliothek der persönlichen Datenbank, PCDL, aus.
Wählen Sie dann aus, erstellen Sie eine neue PCDL. Wählen Sie die Art der PCDL LC/MS-Metabolomik aus. Legen Sie den Namen für PCDL fest.
Wählen Sie dann Erstellen aus. Wählen Sie in der Symbolleiste PCDL und dann die Option Bearbeitung zulassen aus. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Verbindungen suchen.
Verbindungen können der persönlichen Bibliothek auf zwei Arten hinzugefügt werden, indem sie zunächst aus der allgemeinen Bibliothek des Instruments kopiert werden. Öffnen Sie dazu die bisher in der Datenverwaltung enthaltene bestehende Datenbank des Instruments. Klicken Sie auf die Schaltfläche Verbindungen suchen.
Geben Sie in der Option Einzelne Suche die Kriterien für die zusammengesetzte Suche ein, um den Zinseszins zu finden. Wählen Sie in der Tabelle zusammengesetzte Ergebnisse den Zinseszins aus. Wenn Sie mehr als eine Verbindung auswählen möchten, klicken Sie auf die erste Verbindung, halten Sie dann die STRG-TASTE gedrückt, und klicken Sie dann auf die einzelnen Zinseszinspartner.
Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste auf alle markierten Verbindungen und wählen Sie An PCDL anhängen. Suchen Sie im neuen Fenster die spezialisierte persönliche Datenbankdatei, und wählen Sie sie aus. Markieren Sie das Kästchen Spektren für Verbindung einschließen, falls vorhanden.
Klicken Sie auf die Schaltfläche Anhängen. Wählen Sie im neuen Dialogfeld Ja aus, um die neu hinzugefügten Verbindungen zu überprüfen. Wählen Sie Nein aus, um weiter nach weiteren Zinseszinsgruppen zu suchen.
Zweitens können neue Verbindungen manuell hinzugefügt werden, wenn sie nicht in der allgemeinen Bibliothek des Instruments verfügbar sind. Hierfür öffnet sich die spezialisierte persönliche Datenbank. Wählen Sie nach dem Öffnen PCDL und dann die Option Bearbeitung zulassen aus.
Wählen Sie die Option Verbindungen bearbeiten aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Neu hinzufügen. Vervollständigen Sie im oberen Bereich des Fensters die Informationen der neuen Verbindung.
Geben Sie die Formel, den Namen, den IUPAC-Namen, die CAS-Nummer, die Chemspider-ID und andere Identifikatoren ein. Verwenden Sie Informationen, die in den kostenlosen Online-Bibliotheken Chemspider, PubChem und Phenol Explorer verfügbar sind, um die Informationen der neuen Zinseszinsgruppe auszufüllen. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf die Schaltfläche Als neu speichern, um die neuen zusammengesetzten Informationen in der spezialisierten persönlichen Datenbank zu speichern.
Wiederholen Sie den Vorgang mit allen Zinseszinspartnern, um die spezialisierte persönliche Datenbank zu vervollständigen. Verwenden Sie die qualitative Manager-Software des Instruments, um phenolische Verbindungen und phenolische Metaboliten zu identifizieren. Öffnen Sie die Beispieldatei.
Wählen Sie im Bedienfeld "Chromatogramm" die Option "Chromatogramme definieren" und extrahieren Sie das Gesamtionenchromatogramm TIC, das extrahierte Ionenchromatogramm von MS EIC und das EIC von MS/MS. Wählen Sie die Option Chromatogramm integrieren aus. Wählen Sie im Bedienfeld "Verbindungen suchen" die Option "Nach Formeloptionen suchen".
Wählen Sie im neuen Fenster Formelquelle und dann die Datenbank-Schrägstrichbibliotheksoption aus. Suchen Sie die zuvor erstellte persönliche Datenbank und klicken Sie auf Öffnen. Wählen Sie die Formelanpassungsoption aus, und legen Sie eine Massenübereinstimmungstoleranz von fünf Teilen pro Million ppm fest.
Wählen Sie die Option für negative Ionen und wählen Sie nur das Minus-H-Dialogfenster aus. Markieren Sie in der Option Ergebnisse die Dialogfelder EIC extrahieren, bereinigtes Spektrum extrahieren, Rohspektrum extrahieren und strukturierte Dialogfelder einschließen. Wählen Sie die Option Ergebnisfilter aus.
Und dann markieren Sie warnen, wenn Punktzahl ist, dann setzen Sie die Punktzahl Übereinstimmung auf 80% Dann markieren Sie nicht übereinstimmen, wenn die Punktzahl ist und setzen Sie die Punktzahl auf 75% Klicken Sie dann auf die Suche Verbindungen nach Formel, um Verbindungen von Interesse in der Stichprobe zu identifizieren. Der Schritt-für-Schritt-Prozess zur Identifizierung phenolischer Metaboliten durch die semi-gezielte UPLC MS/MS-Analyse von Plasmaproben ist in der nächsten Abbildung dargestellt. Zunächst wurde das gesamte Ionenchromatogramm unter Verwendung einer selbst erstellten PCDL-Datenbank erhalten, die 645 phenolische Verbindungen und ihre Metaboliten enthielt, die aus kostenlosen Online-Datenbanken stammten.
Als nächstes wurden das extrahierte Ionenchromatogramm und das Fragmentierungsmuster oder die Ionen mit weniger als fünf ppm Masse mit einer Übereinstimmungstoleranz erhalten. Schließlich wurde die Isotopenverteilung der nachgewiesenen Peaks mit der der theoretischen Verbindungen verglichen. Aus dieser Analyse wurden insgesamt 25 phenolische Verbindungen und Metaboliten in den Plasmaproben identifiziert.
Um die Wirksamkeit der Designmethode bei der Identifizierung der absorbierenden phenolischen Verbindungen oder ihrer Metaboliten zu bewerten, wurden fünf Proben der Studienteilnehmer analysiert, die vor und nach der 30-tägigen Intervention gewonnen wurden. Die relative Häufigkeit jeder Verbindung wurde berechnet, indem die Fläche unter der Kurve nach der Behandlung durch AUC vor der Behandlung geteilt wurde. Tabelle vier zeigt die Liste der 12 Phenolverbindungen, die nach dem 30-tägigen Verzehr des brosimum alicastrum mehlhaltigen Lebensmittels einen Anstieg des Plasmas zeigten.
Phenylessigsäure war nur Metabolit, der nach der Behandlung konsequent in höherer Konzentration gefunden wurde. Glycitin, ein glykosyliertes Isoflavon, und drei Hydroxyphenylvaleriansäure nahmen in drei der fünf Proben zu, nahmen aber in den anderen beiden ab. Gomisin M2, ein Lignan, wurde in drei der fünf Proben erst nach der Ernährungsintervention nachgewiesen.
Die anderen phenolischen Verbindungen und Metaboliten wurden nur in einer Probe und erst nach der Behandlung gefunden. Die Methode entwickelte vorliegende Arbeit, zeigt, dass es in den meisten Teilen gut für das Ziel geeignet war, für das es geschaffen wurde. Die Probe pro Behandlung war einfach und effektiv.
Die UPLC-Trennung und die semi-zielgerichtete MS/MS-Identifizierung von phenolischen Metaboliten wurden erreicht.
