Dieses Protokoll kann Wissenschaftlern helfen, die daran interessiert sind, die molekulare Funktion menschlicher Astrozyten in ihrer Heimatnische zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Isolierung und Anreicherung eines bestimmten Zelltyps, erwachsener Astrozyten, aus großen menschlichen Hirngewebeproben mittels fluoreszenzaktivierter Kernsortierung ermöglicht. Diese Methodik kann angewendet werden, um andere Zelltypen aus dem menschlichen Neokortex, wie Neuronen und Oligodendrozyten-Vorläuferzellen, unter Verwendung anderer geeigneter fluoreszierender konjugierter Antikörper zu isolieren.
Beginnen Sie mit der Sezierung von etwa 200 bis 400 Milligramm Gewebe aus einer frisch gefrorenen menschlichen erwachsenen Kortexgewebeprobe. Legen Sie das Gewebe in einen sieben Milliliter großen Glasgewebedouncer mit vier Millilitern eiskaltem Lysepuffer auf Eis und mahlen Sie das Gewebe etwa 50 Mal. Überführen Sie das Homogenat in ein 12-Milliliter-Ultrazentrifugen-Polypropylenröhrchen.
Verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Pipette, um 6,5 Milliliter eiskalten Saccharosepuffer in den Boden des Ultrazentrifugenröhrchens zu geben, ohne die Grenzfläche zwischen Saccharose und Gewebehomogenat zu stören. Um die Kerne zu sammeln, zentrifugieren Sie das Lysat eine Stunde lang bei 101, 814 mal G und saugen Sie den Überstand und die Ablagerungen vorsichtig ab, ohne das Pellet zu stören. Geben Sie 0,1% BSA in PBS in das Ultrazentrifugenröhrchen für eine 10-minütige Inkubation auf Eis, bevor Sie das Kernpellet wieder suspendieren.
Verwenden Sie dann Trypanblau, um die intakten Kerne unter einem Lichtmikroskop sichtbar zu machen und sicherzustellen, dass die Konzentration über 10 bis zu den fünften Kernen pro Milliliter liegt Für die fluoreszenzaktivierte Sortierung der isolierten Kerne fügen Sie etwa 20 Mikroliter der resuspendierten Probe zu einer Antikörperlösung hinzu, die Alexa Fluor 555 konjugierten Maus-Anti-NeuN-Antikörper enthält. Fügen Sie etwa 20 Mikroliter der resuspendierten Probe zu einer Antikörperlösung hinzu, die einen APC-konjugierten Maus-Anti-PAX6-Antikörper enthält. Nach einer einstündigen Inkubation bei vier Grad Celsius mit Schütteln, geschützt vor Licht, fügen Sie DAPI im Verhältnis 1:1000 zu allen Proben und Kontrollen hinzu.
Um Kerne der entsprechenden Größe einzuschließen und rote Blutkörperchen und Ablagerungen auszuschließen, verwenden Sie ein Kontrollröhrchen, um die Zellen durch ihre vorderen und seitlichen Streubereiche zu verriegeln. Um die Singulettkernpopulation auszuwählen, gleiten Sie nach Vorwärtsstreubereich gegen Vorwärtsstreubreite oder -höhe und Seitenstreubereich für seitliche Streubreite oder -höhe aus. Gate von DAPI, um nur die intakten Nuclei-Singlets einzuschließen und alle Trümmer und Dubletten auszuschließen.
Nach dem Gating gemäß zusätzlichen Fluoreszenzkontrollen führen Sie die reine DAPI-Kontrollprobe aus. Führen Sie die NeuN Alexa fluor 555-only-Steuerung aus, um den Grenzwert für die NeuN-positive Färbung im Alexa fluor 555-Kanal zu bestimmen. Führen Sie die PAX6-Nur-APC-Steuerung aus, um den Grenzwert für die PAX6-positive Färbung im APC-Kanal zu bestimmen.
Nachdem alle Kontrollen ausgeführt wurden, schließen Sie die NeuN-positiven Zellen an, um die Neuronen zu sammeln, und schließen Sie die PAX6-positiven Zellen mit der NeuN-negativen Population an, um die Astrozyten zu sammeln. Gate und sammeln Sie alle zusätzlichen Glialpopulationen von Interesse aus der NeuN-negativen PAX6-negativen Population. Für die Bulk-Single-Nucleus-RNA-Sequenzierung fügen Sie nach dem Sammeln von 50.000 bis 500.000 Kernen in 0,04%BSA-ergänztem PBS zwei Milliliter Saccharoselösung, 50 Mikroliter einmolares Calciumchlorid und 30 Mikroliter einmolares Magnesiumacetat in die Probe ein.
Bringen Sie das endgültige Volumen der Aufhängung mit PBS auf bis zu 10 Milliliter. Mischen Sie den Röhrcheninhalt durch Inversion und inkubieren Sie die Reaktion auf Eis für 15 Minuten. Pelletieren Sie die Kerne durch Zentrifugation und resuspendieren Sie die Kerne in einem Milliliter RNA-extrahierendem Reagenz.
Dann wirbeln Sie das Rohr um, frieren Sie die Probe auf Trockeneis ein und lagern Sie die Kerne bei minus 80 Grad Celsius. Für die Bulk-Einzelkern-Transposase-akzeptable Chromatin-Sequenzierung sammeln Sie 50.000 bis 75.000 Kerne in 0,04%BSA-supplementiertes PBS in einem Mikrozentrifugenröhrchen, das mit 5%BSA beschichtet ist, und frieren die Kerne bis zu ihrer nachgelagerten Analyse ein. Neuronale, Astrozyten- und Oligodendrozyten-Vorläuferkernpopulationen können aus einer frisch gefrorenen postmortalen humanen temporalen Neokortexprobe sortiert werden, wie gezeigt.
Einzelkern-RNA-Sequenzierungsstudien priorisierten PAX6 als einen der wichtigsten differentiell exprimierten nukleären Transkriptionsfaktoren sowohl in protoplasmatischen als auch in faserigen adulten Astrozyten-Subpopulationen. Nach der Sortierung können zelltypspezifische Transkriptomveränderungen im primären pathologischen Epilepsie-Neokortex charakterisiert werden. In dieser Analyse bestätigten transkriptomische Analysen, dass die PAX6-positiven NeuN-negativen Populationen für Panastrozytenmarker robust angereichert und für neuronale Marker erschöpft waren.
Die Immunfluoreszenzfärbung kann verwendet werden, um die Co-Lokalisation von PAX6 mit glialem fibrillärem saurem Protein in menschlichen kortikalen Astrozyten zu bestätigen. Kürzere Post-mortem-Intervalle sind mit einer größeren intakten Kernerholung aus frischen Gewebeproben verbunden. Eine hohe Ausbeute an intakten Kernen kann aus gefrorenem Gewebe bis zu 24 Stunden postmortal gewonnen werden, aber nach 30 Stunden können nur sehr wenige intakte Kerne wiederhergestellt werden.
Das Wichtigste, woran man sich erinnern sollte, ist, die PAX6-positive Population aus der NeuN-negativen Population zu bekommen, denn es gibt Neuronen, die auch PAX6 exprimieren, und wir wollen diese ausschließen. Diese Technik ermöglichte auch die Untersuchung von Astrozyten in epilepsiechirurgischen Hirnproben, was die molekulare Dysregulation menschlicher Astrozyten im Kontext einer bestimmten pathologischen Nische weiter aufklärte.
