Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung und Verwendung von Hühnerembryonen zwischen dem fünften und achten Tag der Inkubation für kontrastmittelverstärkte Ultraschallbildgebung und Mikroblasen-vermittelte Arzneimittelabgabestudien. Die drei Methoden, um den Inhalt am fünften bis achten Tag aus der Eierschale zu entfernen, ermöglichen seine Entwicklung innerhalb der Schale und erfordern nur grundlegende Laborwerkzeuge. Dieses Modell eignet sich zur Untersuchung verschiedener Aspekte der Ultraschall- und Gefäßforschung wie Blutflussbildgebung, Medikamentenabgabe und neue Ultraschallkontrastmittel und Schallköpfe. Um einen fünf Tage alten Embryo vorzubereiten, legen Sie ein fünf Tage inkubiertes befruchtetes Ei in einen vorgewärmten Eihalter mit dem Ei in der gleichen Ausrichtung wie im Inkubator und verwenden Sie das spitze hintere Ende einer Pinzettenspitze, um eine kleine Vertiefung auf der Oberseite des Eies zu machen.
Verwenden Sie die Pinzette, um eine zweite Vertiefung an der Seite des Eies etwa 2/3 der Länge des Eies zu machen, und verwenden Sie eine größere Pinzette, um ein kleines Stück Eierschale aus dem eingerückten Bereich an der Oberseite des Eies zu entfernen, wobei Sie darauf achten, dass der Luftsack Kontakt mit der Umgebungsluft hat, ohne zu tief in die Schale einzudringen. Mit einer Fünf-Milliliter-Spritze, die mit einer 19-Gauge-Nadel ausgestattet ist, dringen Sie durch die zweite Vertiefung mit der Nadel nach unten in die Schale ein und entnehmen etwa zwei Milliliter Albumin. Wenn das Albumin gesammelt wurde, verwenden Sie Klebeband, um den Einstich zu versiegeln und das Albumin in ein Wiegeboot abzugeben.
Verwenden Sie die große Pinzette, um die kleine Öffnung auf der Oberseite des Eies zu vergrößern, bis der Embryo und die Chorioallantousmembran vollständig sichtbar sind, ohne die Schale unter der Chorioallantoikmembran zu entfernen oder die innere Membran zu durchdringen. Wenn eine ausreichende Öffnung geschaffen wurde, drehen Sie das Ei um 180 Grad innerhalb des Halters, so dass die Öffnung an der Oberseite des Eies nun nach unten zeigt. Nach ein bis zwei Minuten schwimmt der Embryo nach oben und wird von unten unsichtbar.
Wenn der gesamte Embryo und die Chorioallantousmembran aus dem Blickfeld verschwunden sind und nur noch das Eigelb sichtbar ist, entfernen Sie das Klebeband von der seitlichen Öffnung. Das Innere des Eies sollte sich aus der Öffnung wölben. Während Sie den Boden des Eies in der Nähe des Wiegeboots in der Metallwaage halten, verwenden Sie die scharfen Spitzen der kleinen Pinzette, um einen horizontalen Kratzer in der Membran über die gesamte Breite der Öffnung sanft, aber schnell zu machen und den Eiinhalt vorsichtig in das Wiegeboot fallen zu lassen.
Überprüfen Sie, ob der Herzschlag noch vorhanden ist, um zu bestätigen, dass der Embryo noch am Leben ist, die chorioallantoischen Membrangefäße intakt sind und kein Blut oder Eigelb austritt. Platzieren Sie den lebensfähigen Embryo bei 37 Grad Celsius mit regelmäßiger Verabreichung von 30-Mikroliter-Tropfen von 37 Grad Celsius PBS an den Embryo und die Chorioallantoikmembran. Um einen sechs bis sieben Tage alten Embryo und eine chorioallantoische Membran zu ernten, bereiten Sie das Ei wie für einen fünf Tage alten Embryo demonstriert vor und verwenden Sie eine neue Fünf-Milliliter-Spritze, die mit einer 19-Gauge-Nadel ausgestattet ist, um die Schale durch die zweite Vertiefung zu durchdringen, wobei die Nadel nach unten zeigt, um fünf bis sechs Milliliter Albumin in einer einzigen Penetration zu entnehmen.
Wenn das Albumin gesammelt wurde, führen Sie die Nadel einer 10-Milliliter-Spritze, die etwa einen Milliliter 37 Grad Celsius PBS, mehr als das entnommene Volumen, enthält, in die Seite der Schale ein, wobei die Nadel nach unten zeigt, um das entnommene Albumin zu ersetzen. Dann verschließen Sie den Spalt schnell wieder mit einem Stück Klebeband und beenden Sie die Verarbeitung des Eies wie gezeigt. Um den Embryo und die Chorioallantoic-Membran aus einem acht Tage alten befruchteten Ei zu ernten, halten Sie das Ei horizontal, verwenden Sie das hintere Ende einer großen Pinzette und machen Sie eine kleine Vertiefung etwa auf halber Höhe der Länge des Eies.
Machen Sie kleine Vertiefungen in einem Ringmuster 360 Grad um den Eierschalenraum, der etwa 10 Millimeter voneinander entfernt ist. Wenn alle Vertiefungen erstellt wurden, verwenden Sie das spitze Ende der Pinzette, um die Schale zwischen zwei der Vertiefungen zu knacken, und tauchen Sie das Ei fünf Minuten lang vollständig in 37 Grad Celsius PBS ein. Am Ende der Inkubation bewegen Sie das Ei über ein Wiegeboot im PBS und legen beide Daumen in das große Loch, um das Ei vorsichtig zu öffnen, das entlang der kleinen Vertiefungen reißen sollte.
Wenn sich der Riss um die Eierschale gebildet hat, ziehen Sie die beiden Seiten vorsichtig auseinander, während Sie die Stücke vorsichtig hin und her bewegen, bis der Eiinhalt von der Schale getrennt ist, und lassen Sie den Inhalt in das Wiegeboot fallen. Heben Sie langsam das Wiegeboot mit dem Eierinhalt aus dem PBS an und neigen Sie das Boot leicht, um überschüssiges PBS zu entfernen. Legen Sie dann das Wiegeboot in einen Metallwaagenhalter.
In diesem Stadium kann ein schlagendes Herz im Embryo gesehen werden. Um eine embryonale und chorioallantoische Membranprobe für die mikroskopische Bildgebung vorzubereiten, legen Sie einen Halter mit einer akustischen Membran mit Agarose auf den Boden einer Einstreu-Petrischale mit etwa 500 Milliliter 37 Grad Celsius PBS mit der Agaroseschicht nach oben. Verwenden Sie eine kleine Schere, um schnell in die Vitellusmembran in sechs bis sieben Schnitten um die gesamte chorioallantoische Membran zu schneiden, während Sie das Wiegeboot für eine bessere Präzision und Geschwindigkeit drehen.
Verwenden Sie einen Esslöffel, um die ausgeschnittene Membran mit dem Embryo und der Chorioallantoic-Membran zu schöpfen, und heben Sie den Löffel langsam an, um eine visuelle Inspektion zu ermöglichen, ob die ausgeschnittene Membran mit dem Embryo und der Chorioallantoic-Membran noch mit dem Rest der Dottersackmembran verbunden ist. Neigen Sie den Löffel leicht, um so viel Eigelb wie möglich loszuwerden, ohne das Gewebe auszutrocknen, und tauchen Sie die ausgeschnittene Membran in die PBS in die Ein-Liter-Petrischale. Greifen und schwenken Sie mit einer kleinen Pinzette vorsichtig eine Kante der Membran, um das noch angebrachte Eigelb zu entfernen, bevor Sie die Membran über den Halter mit der akustischen Membran bewegen.
Verwenden Sie einen Insektenprobenstift, um die Membran an gegenüberliegenden Ecken des Halters zu befestigen und ein Durchstechen der Chorioallantoic-Membrangefäße zu vermeiden. Wenn beide Ecken gesichert sind, heben Sie den Halter an und neigen Sie ihn leicht, um den größten Teil des PBS zu entsorgen, und verwenden Sie die kleine Pinzette, um die Membran zu dehnen und gleichmäßig über den Halter zu verteilen, damit der Rest der Membran flach an den Halter geheftet werden kann. Wenn der Embryo gesichert ist, legen Sie den Halter in einen Mikroskopieaufbau bei 37 Grad Celsius und legen Sie eine akustisch und optisch transparente Membran über den interessierenden Bereich der Probe, um die optische Visualisierung der Gefäße zu ermöglichen.
In dieser repräsentativen Analyse wurden wie gezeigt fünf, sechs, sieben und acht Tage alte Embryonen und Chorioallantousmembranen entfernt. Es können keine Blutungen oder Schäden an den Embryonen oder Chorioallantousmembranen beobachtet werden, was darauf hindeutet, dass diese Methoden verwendet werden können, um den Eiinhalt sicher zu ernten, ohne den Embryo oder die chorioallantoischen Membrangefäße zu schädigen. Während der Extraktion können mehrere Komplikationen auftreten, daher ist es wichtig, das Protokoll sorgfältig zu befolgen und beschädigte Gewebeproben zu entsorgen.
Wie gezeigt, kann dem Embryo beispielsweise Ultraschallkontrastmittel wie Mikrobläschen injiziert werden. Nach der Abgabe können die Mikroblasen beobachtet werden, wie sie im Lumen des injizierten Blutgefäßes zirkulieren und mehrere Stunden im peripheren Blut zirkulieren. Vor der Mikroblaseninjektion kann der Kontrast bereits im embryonalen Herzen im B-Modus beobachtet werden, nicht jedoch bei der subharmonischen Hochfrequenz-Ultraschallbildgebung.
Die Zugabe von Mikrobläschen erhöht den Kontrast und die Sichtbarkeit des Embryos in beiden Arten von Bildern. Hochfrequente subharmonische 3D-Bilder können auch nach Kontrastmittelinjektion erhalten werden, um Gefäßnetzwerke innerhalb des Embryos und der Chorioallantoischen Membran sichtbar zu machen. Der Hühnerembryo und die chorioallantoischen Membrangefäße können auch verwendet werden, um die ultraschallvermittelte Wirkstoffabgabe zu untersuchen.
Bei diesem Verfahren ist es am wichtigsten, den Embryo und die CAM immer bei 37 Grad Celsius zu halten und nicht austrocknen zu lassen. Nach diesem Verfahren kann der Hühnerembryo in verschiedene Setups platziert werden, z. B. in einen Wassertank oder ein Mikroskop, um kontrastverstärkte Ultraschallbildgebung oder Mikroblasen-vermittelte Arzneimittelabgabestudien durchzuführen. Diese Methode und Zubereitung eignet sich für Ultraschall-Kontrastmitteluntersuchungen und kann auch für die Krebs- und Virusforschung eingesetzt werden.
