Dieses hämodynamische Schleifenmodell ermöglicht es Forschern, die In-vitro-Hämokompatibilität von Gefäßgeräten wie Perfusionsschläuchen oder Stents zu testen. unter standardisierten Bedingungen. Diese Technik wirkt sich also nicht durch mechanische Kraft auf das Blut aus und vermeidet so die irreführenden Ergebnisse durch intrinsische Aktivierung der Blutbestandteile.
Vor dem Versuch eines Experiments müssen die richtige mechanische Teilemontage, die perfekte Schleifenverschlusssystemkonstruktion und die langsame Blutbelastung in die Schleifen geübt werden. Um die Schleifenbaugruppe vorzubereiten, schneiden Sie mit einem Rohrschneider 250 Zentimeter lange, fünf Millimeter Innendurchmesser von Rohren auf einer ebenen Oberfläche. Und stecken Sie die offenen Endungen der Rohre in ein kurzes Stück Silikonrohr, das den Außendurchmesser des Untersuchungsrohres anpasst, um eine Schleifenform zu erzeugen.
Ziehen Sie die Verriegelungsschraube des Spannbandverbinders vorsichtig fest und stellen Sie die Schließkraft so ein, dass kein Spalt zwischen den beiden Biegungen verbleibt. Wenn die Verriegelungsschraube vollständig angezogen ist und die Spannung des Polycarbonatbandes zu niedrig erscheint, um den Spalt zwischen den beiden Biegungen zu schließen, öffnen Sie das Verriegelungssystem und schneiden Sie einige Millimeter des Spannbandes. Um eine Stent-Loop-Baugruppe vorzubereiten, öffnen Sie zwei der Schleifen und nehmen Sie das Rohr aus dem Zugbandsystem.
Dann legen Sie den Stent in die Mitte des Rohres, wie vom Hersteller angewiesen. Wenn die entsprechende Anzahl von Schleifen für das Experiment erzeugt wurde, sichern Sie die Schleifen in der Schleifenwiege der Rotationseinheit, außerhalb eines 37-Grad-Wasserbades, und befestigen Sie die Schleifenwiege an der Rotationseinheit im Wasserbad. Als nächstes füllen Sie eine 10-Milliliter-Spritze für alle zwei Blutschlaufen, die mit 150 Mikrolitern oder frisch zubereiteter Heparin-Stammlösung gesammelt werden sollen, und verwenden Sie einen 21-Meter-Schmetterling, um sanft Blut in die Spritzen zu sammeln, wobei darauf geachtet wird, Homolyse oder Zellaktivierung aufgrund übermäßigen Vakuums zu vermeiden.
Wenn das gesamte Blut gesammelt wurde, übertragen Sie das Blut in ein Glasbecher glasbechern und verwenden Sie eine fünf Milliliter serologische Pipette, um das Blut und Heparin sanft zu mischen. Wenn eine homogene Lösung mit der PipetteSpitze erhalten wurde, die nicht vollständig in das Rohr eingeführt wurde, füllen Sie jede Schleife sorgfältig mit fünf Milliliter Blut. Schließen Sie jede Schleife, nachdem sie gefüllt wurde, und bestätigen Sie, dass die Schleife, das Spannungsband und das Rack ordnungsgemäß gesichert sind.
Drehen Sie dann die Schleifen für drei Stunden bei 30 Umdrehungen pro Minute. Lassen Sie am Ende der Drehung die Schlaufen zwei Minuten lang im Rack stehen, damit sich das Blut an den Schlaufenböden ansammeln kann, bevor Sie vorsichtig die Anschlüsse öffnen und das Blut aus Duplikaten in einzelne 10 Milliliter Glasbecher ziehen. Wenn das gesamte Blut gesammelt wurde, spülen Sie jede Röhre mit 10 Milliliter PBS und verwenden Sie ein Skalpell, um sorgfältig eine ein Zentimeter große Probe vom Ende jeder Röhre zu schneiden.
Inkubieren Sie die Proben über Nacht in 2%glutaraldehyd bei vier Grad Celsius, gefolgt von einer 15-minütigen Inkubation und 1%Osmiumtetroxid bei Raumtemperatur. Am Ende der Osmiumtetroxid-Inkubation die Proben in einer aufsteigenden Ethanol-Serie für 20 Minuten pro Konzentration dehydrieren, gefolgt von einer 30-minütigen Dehydrierung in 100%Ethanol. Lassen Sie die Proben am Ende der 100%ethanol-Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur trocknen, bevor Sie die Proben mittels Rasterelektronenmikroskopie mit einer Beschleunigungsspannung von fünf Kilovolt mit einem Röntgen-Mikro-CT-Scanner abbilden.
Zur zytometrischen Durchflussanalyse der Blutproben. Übertragen Sie 100 Mikroliter Blut aus jeder Probe in jede der neun Fünf-Milliliter-FACS-Röhren und fixieren Sie die Proben mit 100 Mikrolitern Formaldehyd pro Tube für 15 Minuten bei Lichtschutz. Nach dem Waschen jedes Pellet in einem Milliliter roter Blutzelllysepuffer pro Röhre für eine fünfminütige Inkubation bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt, wieder aufhängen.
Am Ende der Inkubation die Proben durch Zentrifugation in einem Milliliter PBS pro Tube waschen und ohne ihre Überwälstmittel auf Eis legen. Zur Herstellung einzelner Fleckenkompensationsperlen fügen Sie vier Tropfen positiver und vier Tropfen negativer Perlen zu einzelnen ein Milliliter Volumen des FACS-Puffers hinzu und wirbeln die Lösungen, um homogene Perlensuspensionen zu erhalten. Fügen Sie 100 Mikroliter jeder Lösung zu jeder von vier oder fünf Milliliter FACS-Röhren, die als angegeben gekennzeichnet sind, und waschen Sie die Perlen mit einem Milliliter FACS-Puffer pro Tube.
Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter des entsprechenden Wirbel-Antikörper-Cocktails zu jedem experimentellen und Fluoreszenz minus einer Röhre mit sanfter Mischung hinzu. Für eine 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt. Am Ende der Inkubation die Proben mit einem Milliliter frischer FACS-Puffer pro Probe waschen und Pellets in 250 Mikroliter FACS-Puffer pro Tube wieder aufsuspendieren.
Vor der Analyse der Perlen auf Zellproben durch Durchflusszytometrie, nach Standardprotokollen. Blutzellverteilungen können über die gesamte Oberfläche von zwei gespleißten Bloops durch Mikro-CT und Rasterelektronenmikroskop-Bildgebung visualisiert werden, während in geschlossenen Schleifen ohne Lücken keine Gerinnsel beobachtet werden. Analyse der Gesamtblutzellzahl, zeigt keine signifikanten Unterschiede in Erythrozyten zahlen zwischen einem der getesteten Bedingungen, Thrombozyten- und Leukozytenzahlen jedoch sind drastisch in der Latex-Schleife-Gruppe reduziert und freie Hämoglobin-Zahlen sind dramatisch erhöht, was auf eine sehr schlechte Biokompatibilität von Latex.
Während alle getesteten Gefäßgeräte eine erhöhte Aktivierung des Gerinnungssystems und der Komplimentkomponente induzieren. Die heparinbeschichteten PVC-Schleifen weisen einen Trend zu einem Rückgang der beiden Arten von Aktivierungen im Vergleich zu polymerbeschichteten PVC-Schlaufen auf. Latexschleifen weisen die höchsten Konzentrationen von TNF IL-6 und PMN-Elastase auf, was die starke Aktivierung von Leukozyten durch Latex unterstreicht.
CD41-Positivplättchen, die aus Latexröhren gewonnen werden, weisen eine extrem hohe mediane Fluoreszenzintensität für CD62P auf, während die integrierte Expression bei Granulozyten und Lymphozyten drastisch reduziert wird. Von Interesse sind integrale Ebenen in Monozyten aus Latexröhren höher, was auf monozyte aktivierte Thrombozytenwechselwirkungen hindeutet. Tatsächlich zeigt die Färbung von Monozytenplättchenaggregaten eine erhöhte Tendenz zur Aggregation in Latex- und Stentschleifen.
Trotz der reduzierten Häufigkeit von Monozyten in Latexschleifen. Um die Aktivierung der intrinsischen Blutkomponente zu vermeiden, ist es wichtig, einen richtigen Schlaufenverschluss zu gewährleisten und das Blut mit Sorgfalt zu behandeln. Nach diesem Verfahren ist es möglich, die Wechselwirkung zwischen allogenen Proteinen oder TRUCKs und Blutbestandteilen zu analysieren, die in der Entzündung oder pharmazeutischen Forschung verwendet werden.
