Name: native cell membrane nanoparticles system for membrane protein-protein interaction analysis
Uploaded: 2020-07-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis at JoVE.com

Diese Forschung wurde vom VCU Startup Fund (zu Y.G.) und dem National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health unter der Award-Nummer R01GM132329 (zu Y.G.) unterstützt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar. Wir danken Montserrat Samso und Kevin McRoberts für ihre großzügige Unterstützung bei der Videoaufnahme.

1. Proteinexpression
<ol><li>Impfung von 15 ml Terrific Broth (TB) Medien mit plasmidspezifischen Antibiotika mit BL21(DE3) pLysS-Zellen, die die AcrB-Exzids in 50 ml-Röhrchen über Nacht bei 37 °C mit Schütteln bei 250 U/min exemitenken.</li>
	<li>Überprüfen Sie die optische Dichte der Nachtkultur bei 600 nm (OD600) und stellen Sie sicher, dass sie über 2,0 liegt.</li>
	<li>5 ml Zellkultur in 1 L TB-Medien verdünnen, die plasmidspezifische Antibiotika enthalten, und bei 37 °C mit Schütteln bis OD600=0,8 inkubieren und dann mit IPTG induzieren, das eine Endkonzentration von 1 mM aufweist.</li>
	<li>Induktion bei 20 °C mit Schütteln für 20 h durchführen.</li>
	<li>Pellet die Zellen mit Zentrifugation für 15 min bei 4 °C und 4.000 x g.</li>
</ol>2. Zelllyse und Membranisolierung
<ol><li>Setzen Sie das Zellpellet in Puffer A(Tabelle 1, Verwenden Sie DDM-Puffer A oder NCMNs-Puffer A je nach dem zu folgenden Reinigungsschema) mit 80 ml für jeweils 20 g des Zellpellets aus.</li>
	<li>Homogenisieren Sie die resuspendierten Zellpellets mit einem Glas-Dounce-Homogenisator bei 4 °C oder bei Raumtemperatur sofort danach auf Eis legen.</li>
	<li>Die Probe in ein Metallbecher glasen auf Eis geben und die Zellen durch Beladen in einen Hochdruckhomogenisator bei 4 °C und 1.500 bar lysieren.<ol>
<li>Wiederholen Sie den Vorgang des Ladens der Zellen in den Homogenisator und lassen Sie sie durch den Homogenisator für 3-4 Zyklen passieren oder bis das Lysat beginnt zu klären.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Lysat bei 15.000 x g für 30 min bei 4 °C.</li>
	<li>Den Überstand sammeln und bei 4 °C bei 215.000 x g bei 215.000 x g in Ultrazentrifugenrohre und Zentrifuge laden.</li>
	<li>Entsorgen Sie den Überstand und sammeln Sie die Membranpellets aus den Ultrazentrifugenrohren. Überschüssiges Membranpellet bei -80 °C lagern.</li>
</ol>3. Herstellung von nativen Zellmembran-Nanopartikeln
<ol><li>1 g Membranpellet in 10 ml NCMNs Puffer A (Tabelle 1) aufheben</li>
	<li>Homogenisieren Sie die resuspendierte Zellmembranprobe mit einem Glas-Dounce-Homogenisator bei 20 °C.</li>
	<li>Übertragen Sie die suspendierte Membranprobe auf ein 50 ml Polypropylenrohr und fügen Sie membranaktive Polymere Lagerlösung und zusätzliche NCMNs Puffer A hinzu, um die Probe auf eine Endkonzentration von 2,5% (w/v) Membran-aktivem Polymer (NCMNP1-1 oder NCMNP5-2) zu bringen. HINWEIS: Lagerlösungen von membranaktiven Polymeren sollten in doppelt destilliertem Wasser hergestellt werden und können in unterschiedlichen Konzentrationen gehalten werden, in der Regel jedoch 10 % (w/v).</li>
	<li>Schütteln Sie die Probe für 2 h bei 20 °C.</li>
	<li>Die Probe in eine Ultrazentrifuge laden und bei 150.000 x g bei 1 h bei 20 °C drehen.</li>
	<li>Während die Probe ultrazentrifugiert wird, beginnen Sie, eine 5 ml Ni-NTA-Säule mit 25 ml NCMNs Puffer A auszubalancieren.</li>
	<li>Sammeln Sie den Überstand, nachdem die Ultrazentrifugation abgeschlossen ist, und laden Sie ihn mit einer Spritzenpumpe auf 5 ml Ni-NTA-Säule bei Raumtemperatur mit einer Durchflussrate von 0,5 ml/min.</li>
	<li>Waschen Sie schnelle Proteinflüssigkeitschromatographie (FPLC) Linien mit genügend NCMNs Puffer B (Tabelle 1), um das System vollständig zu spülen und dann die Säule mit der FPLC-Maschine zu verbinden.</li>
	<li>Waschen Sie die Säule mit 30 ml NCMNs Puffer B mit einer Durchflussrate von 1 ml/min und sammeln Sie den Durchfluss durch.</li>
	<li>Waschen Sie die Säule mit 30 ml NCMNs Puffer C (Tabelle 1) mit einer Durchflussrate von 1 ml/min und sammeln Sie den Durchfluss durch.</li>
	<li>Das Protein mit 20 ml NCMNs Puffer D (Tabelle 1) mit einer Durchflussrate von 0,5 ml/min und die Probe mit einem Fraktionskollektor und den jeweils auf 1,0 ml eingestellten Fraktionen zu sammeln.</li>
	<li>Bewahren Sie die Proteinproben bei 4 °C auf.</li>
	<li>Führen Sie einen SDS-PAGE-Gelelektrophorese-Assay durch, um die Proben zu überprüfen, die den im FPLC-Elutionsdiagramm beobachteten Spitzen entsprechen.</li>
</ol>4. SDS-PAGE Gelelektrophorese
<ol><li>Bereiten Sie die Gießkammer vor, indem Sie das Glas an das Gießgerät spannen.</li>
	<li>Bereiten Sie das 12% Trenngel nach dem in Tabelle 1aufgeführten Rezept vor. HINWEIS: Sobald TEMED hinzugefügt wurde, wird das Gel schnell polymerisieren, so fügen Sie diese nur einmal bereit, das Gel zu gießen.</li>
	<li>Gießen Sie das Gel, so dass 2 cm unter der Unterseite des Kamms für das Stapelgel.</li>
	<li>Entfernen Sie alle Blasen, indem Sie die Oberseite des Gels mit 100% Isopropanol schichten und warten, bis das Trenngel polymerisiert ist.</li>
	<li>Entfernen Sie das Isopropanol und waschen Sie alle Spuren des Isopropanols mit destilliertem Wasser aus.</li>
	<li>Bereiten Sie das Stapelgel gemäß dem in Tabelle 1aufgeführten Rezept vor. HINWEIS: Sobald TEMED hinzugefügt wurde, wird das Gel schnell polymerisieren, so fügen Sie diese nur einmal bereit, das Gel zu gießen.</li>
	<li>Gießen Sie das Stapelgel auf das Trenngel.</li>
	<li>Fügen Sie einen Kamm in die Kammer, um die Brunnen zu bilden und warten, bis das Stapelgel vollständig polymerisiert.</li>
	<li>Legen Sie 1 L 1 M DTT in ein Mikrozentrifugenrohr für jede Bruchprobe, die auf dem Gel ausgeführt werden muss.</li>
	<li>Fügen Sie jedem Rohr auch 7 l 4x Ladepuffer hinzu.</li>
	<li>Fügen Sie jedem Mikrozentrifugenrohr 20 L Proben aus den Fraktionen hinzu, die auf dem Gel ausgeführt werden müssen.</li>
	<li>Wirbel die Rohre, die die Proben enthalten.</li>
	<li>Drehen Sie die Probenröhrchen mit einer Tisch-Mikrozentrifuge für 3 s nach unten und stellen Sie sicher, dass die gesamte Probe auf den Boden der Rohre zurückgekehrt ist.</li>
	<li>Bereiten Sie die Gelelektrophoresezelle vor, indem Sie eine 12% Polyacrylamid-Gelkassette einstecken und die inneren und äußeren Kammern der Zelle mit Tris-Acetat-EDTA (TAE) Buffer füllen (Tabelle 1).</li>
	<li>Laden Sie die Molekulargewichtsmarkierung mit dem entsprechenden Volumen, das in den Anweisungen vorgeschrieben ist, in die erste Spur des Gels ein.</li>
	<li>Laden Sie 28 l der Probe aus jedem Rohr gemischt mit DTT und Ladepuffer.</li>
	<li>Legen Sie den Deckel der Elektrophoresezelle auf die Box und stecken Sie den Deckel in das Netzteil.</li>
	<li>Schalten Sie das Netzteil ein und stellen Sie es auf 100 V ein und lassen Sie es 20 min laufen.</li>
	<li>Nach 20 min erhöhen Sie den Netzstrom auf 140 V und führen Sie ihn weitere 30-40 min laufen oder bis das Band des Ladepufferfarbstoffs den Boden der Gelkassette erreicht.</li>
	<li>Nach Abschluss der Elektrophorese Fleck und Entfleckung des Gels, um die Proteinbänder im Gel enthalten zu visualisieren.</li>
</ol>5. Proteinreinigung mit DDM
HINWEIS: Der Zweck dieser Reinigung ist es, als Kontrolle für die Experimente unter Verwendung der membranaktiven Polymere zu dienen.
<ol><li>6-10 g Membranpellet ab Schritt 2.6 in DDM-Puffer A (Tabelle 1) mit 5 ml/g Membranpellet aufheben.</li>
	<li>Homogenisieren Sie die resuspendierte Probe mit einem Glas-Dounce-Homogenisator bei 4 °C oder wenn bei Raumtemperatur sofort danach auf Eis gelegt werden.</li>
	<li>Die Probe in ein 50 ml Polypropylenrohr übertragen und DDM und zusätzlichen DDM-Puffer A hinzufügen, um die Probe auf eine Endkonzentration von 2% DDM zu bringen.</li>
	<li>Schütteln Sie die Probe für 2 h bei 4 °C.</li>
	<li>Die Probe in Ultrazentrifugenrohre und Zentrifuge für 1 h bei 4 °C und 150.000 x gladen.</li>
	<li>Während die Probe ultrazentrifugiert wird, beginnen Sie mit der Vorbereitung der 5 ml Ni-NTA-Säule durch Waschen mit 25 ml DDM-Puffer A (Tabelle 1).</li>
	<li>Nach Abschluss der Ultrazentrifugation den Überstand sammeln und mit einer Spritzenpumpe bei 4 °C bei 4 °C auf die 5 ml Ni-NTA-Säule laden.</li>
	<li>Waschen Sie FPLC-Leitungen mit genügend DDM-Puffer B + 0,05% DDM (Tabelle 1), um das System vollständig zu spülen und dann die Säule an die FPLC-Maschine anzuhängen.</li>
	<li>Waschen Sie die Säule mit 30 ml DDM-Puffer B + 0,05% DDM mit einer Durchflussrate von 1 ml/min und sammeln Sie den Durchfluss durch.</li>
	<li>Waschen Sie die Säule mit 30 ml DDM-Puffer C + 0,05% DDM (Tabelle 1) mit einer Durchflussrate von 1 ml/min und sammeln Sie den Durchfluss durch.</li>
	<li>Das Protein mit 20 ml DDM-Puffer D + 0,05% DDM (Tabelle 1) bei einer Durchflussrate von 0,5 ml/min zu versenken und den Durchfluss mit einem Bruchkollektor und den jeweils auf 1,0 ml eingestellten Fraktionen zu sammeln.</li>
	<li>Wählen Sie die Fraktionen, die den Elutionsspitzenfürst für die Pooling- und Konzentrationsspitze enthalten, mit einem Zentrifugalkonzentrator und Zentrifugieren bei 4.000 x g und 4 °C bis zu 500 l.</li>
	<li>Laden Sie die Probe mit einer 500-L-Schleife in die FPLC-Maschine und dann bei 4 °C in die 25 ml-Aussperrsäule. Elute mit 30 ml DDM Puffer E + 0,05% DDM (Tabelle 1) bei einer Durchflussrate von 0,5 ml/min und sammeln als Brüche mit den Bruchgrößen auf 0,5 ml pro Bruch eingestellt.</li>
	<li>Nehmen Sie die Fraktionen und messen Sie die Proteinkonzentration mit 280 nm Absorption, um die UV-Vis-Kurve aus dem FPLC-Elutionsdiagramm zu bestätigen.</li>
	<li>Sammeln Sie 20 l aus jeder Stichprobenfraktion, die den im FPLC-Elutionsdiagramm beobachteten Spitzen entspricht und mit dem Absorptionstest als genau bestätigt wurde.</li>
	<li>Den Rest dieser Probenfraktionen mit flüssigem Stickstoff oder Trockeneis in den gewünschten Aliquots einfrieren und Proteinproben bei -80 °C lagern.</li>
	<li>Führen Sie einen SDS-PAGE-Gelelektrophorese-Assay durch, wie zuvor beschrieben, um die Proben zu überprüfen, die den im FPLC-Elutionsdiagramm beobachteten Spitzen entsprechen.</li>
</ol>6. Negative Fleckengittervorbereitung
<ol><li>Platzieren Sie die Gitter, die für die Probenvorbereitung verwendet werden, auf einem in Filterpapier eingewickelten Glasschlitten mit nach oben gerichteter Carbonseite.</li>
	<li>Legen Sie den Glasschlitten mit den Elektronenmikroskopgittern in die Kammer eines Glüh-Entladers zwischen den beiden Elektroden und ersetzen Sie den Glasdeckel, um sicherzustellen, dass er zentriert und gut versiegelt ist.</li>
	<li>Führen Sie die Glühlöschmaschine aus und stellen Sie sicher, dass das vom Plasma erzeugte violette Licht sichtbar ist.</li>
	<li>Wenn die Maschine fertig läuft, warten Sie, bis die Kammer den atmosphärischen Druck erreicht hat, um den Glasdeckel zu entfernen, und kehren Sie dann den Schlitten mit den Gittern auf die Bank zurück, wo Proben auf sie geladen werden.</li>
	<li>Stellen Sie die Konzentration der gereinigten Proteinproben auf etwa 0,1 mg/ml ein, indem Sie die Probe entweder mit dem entsprechenden Puffer verdünnen oder sich mit einem Zentrifugalkonzentrator konzentrieren.</li>
	<li>3,5 l Proteinprobe auf das 10 nm dicke Kohlenstoffgitter laden und 1 min warten.</li>
	<li>Entfernen Sie die Flüssigkeit mit einem Filterpapier von der Oberfläche des EM-Gitters.</li>
	<li>Waschen Sie die Gitteroberfläche 3x, indem Sie 3 L Wassertröpfchen mit dem Gitter aufnehmen und das Wasser mit Filterpapier zwischen den Tropfen entfernen.</li>
	<li>Waschen Sie die Gitteroberfläche 2x, indem Sie 3 L Tröpfchen frisches, gefiltertes 2% Uranacetat aufnehmen und die Waschlösungen auf dem Gitter mit Filterpapier zwischen den Entnahmen jedes Tröpfchens entfernen.</li>
	<li>Färben Sie das Gitter mit einem 3 L Tröpfchen frisch, gefiltert 2% Uranacetat für 1 min.</li>
	<li>Entfernen Sie die Uranacetatlösung auf der Oberfläche des EM-Gitters mit Filterpapier und trocknen Sie das Gitter mindestens 1 min.</li>
	<li>Speichern Sie das Raster feld in einem Rasterfeld für die spätere Verwendung.</li>
</ol>7. EM-Bildgebung
<ol><li>Laden Sie das vorbereitete Gitter an einer sicheren Werkbank in den Gitterhalter.</li>
	<li>Bereiten Sie das Mikroskop vor, indem Sie die Mikroskope in eine Polystyrol-Box legen und den Dewar 3/4 voller flüssigem Stickstoff füllen.</li>
	<li>Bestätigen Sie, dass die Gummiabdeckung des Mikroskopfensters es bedeckt, und laden Sie den Dewar dann auf das Mikroskop, indem Sie die Kupferdrähte in den Dewar legen, bis er auf die Plattform passt.</li>
	<li>Füllen Sie den Rest des Krieges mit flüssigem Stickstoff und legen Sie eine Kappe auf den Dewar, um ihn zu bedecken.</li>
	<li>Schalten Sie die Hochspannung ein, konditionieren Sie das Mikroskop und warten Sie, bis sich das Mikroskop erwärmt und einen sicheren Vakuumpegel für den Einsatz festlegt.</li>
	<li>Sobald das Mikroskop fertig ist, öffnen Sie das Säulenventil und bestätigen Sie, dass der Strahl vorhanden ist, indem Sie die Gummiabdeckung am Mikroskopfenster entfernen.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Strahlstigmation, indem Sie sich in und aus ausbreiten, indem Sie die Intensität des Strahls anpassen. Wenn Astigmatismus vorhanden ist, wird der Strahl eine elliptische Form haben, wenn man sich vom Cross-over entfernt und der Strahl sollte auf beiden Seiten die gleiche ovale Form haben.</li>
	<li>Passen Sie das Mikroskop-Fernglas so an, dass es die richtige Höhe und den richtigen Abstand gemäß den Augen des Beobachters hat.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Strahlpositionierung für Such-, Fokus-und Belichtungsmodi, indem Sie durch alle drei Modi radeln, bis der Strahl in jedem Modus zentriert ist.</li>
	<li>Schließen Sie das Säulenventil, und laden Sie den Gitterhalter in das Elektronenmikroskop.</li>
	<li>Stellen Sie das Mikroskop auf die euzentrische Höhe ein, indem Sie die Wackelfunktion der Mikroskope verwenden und die Bewegung der Bühne mithilfe der Z-Achse anpassen, bis sich keine Seitenbewegung der Probe in der Mitte befindet.</li>
	<li>Mit dem niedrig dosierten Suchmodus am Mikroskop suchen Sie das Raster nach einem wünschenswerten Bereich von vernünftigem Kontrast zu den vorhandenen Probenmolekülen, um sich auf die Probe zu konzentrieren.</li>
	<li>Konzentrieren Sie sich im Fokusmodus auf die Stichprobe, indem Sie eine hohe Schrittgröße verwenden, bis die Stichprobe angezeigt wird, und verringern Sie dann die Schritte, um die richtige Fokusebene zu finden.</li>
	<li>Null und leeren Sie den Strahl und stellen Sie dann sicher, dass das Gummipad das Mikroskopfenster bedeckt.</li>
	<li>Nehmen Sie mit dem Belichtungsmodus das Bild der gewünschten Rasterfläche für eine Belichtungszeit von 1 s bei 62.000-facher Vergrößerung auf und überprüfen Sie das erhaltene Bild.</li>
	<li>Wenn die Bildgebung erfolgt ist, schließen Sie die Säulenventile und entfernen Sie den Gitterhalter aus der Säule.</li>
	<li>Wenn die Bildgebung abgeschlossen ist, schalten alle von Interesse sind den Mikroskop ab, indem sie die Filamentleistung ausschalten und den Flüssigstickstoff-Dewar aus dem Mikroskop entfernen.</li>
	<li>Legen Sie etwas, um Feuchtigkeit auf dem Ständer zu absorbieren, wo der Dewar saß, um Kondensation von den Kupferspulen des Mikroskops zu fangen.</li>
	<li>Aktivieren Sie den Cryo-Zyklus-Modus und stellen Sie sicher, dass die Turbopumpe ausgeschaltet ist.</li>
</ol>

<ol>
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(90), e51087 (2014).</li><li>Lee, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+detergent-free+isolation+of+membrane+proteins+in+their+local+lipid+environment.">A method for detergent-free isolation of membrane proteins in their local lipid environment.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1149-1162 (2016).</li><li>Hall, S. C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+acid-compatible+co-polymer+for+the+solubilization+of+membranes+and+proteins+into+lipid+bilayer-containing+nanoparticles.">An acid-compatible co-polymer for the solubilization of membranes and proteins into lipid bilayer-containing nanoparticles.</a> Nanoscale. 10 (22), 10609-10619 (2018).</li><li>Oluwole, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubilization+of+Membrane+Proteins+into+Functional+Lipid-Bilayer+Nanodiscs+Using+a+Diisobutylene/Maleic+Acid+Copolymer.">Solubilization of Membrane Proteins into Functional Lipid-Bilayer Nanodiscs Using a Diisobutylene/Maleic Acid Copolymer.</a> Angewandte Chemie International Edition England. 56 (7), 1919-1924 (2017).</li></ol>

Y.G ist als Erfinder des membranaktiven Polymers NCMNP5-2 und des NCMN Systems gelistet.

Protein-Protein-Wechselwirkungen sind wichtig für die Integrität der Struktur und Funktion von Membranproteinen. Viele Ansätze wurden entwickelt, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen. Im Vergleich zu löslichen Proteinen sind Membranproteine und ihre PPI aufgrund der einzigartigen intrinsischen Eigenschaften von Membranproteinen schwieriger zu untersuchen. Diese Schwierigkeit ergibt sich vor allem aus der Anforderung von Membranproteinen, die in eine native Lipid-Bilayer-Umgebung eingebettet werden müss...

Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI) spielen in der gesamten Biologie eine zentrale Rolle, von der Aufrechterhaltung der Struktur und Funktion von Proteinen bis hin zur Regulierung ganzer Systeme. PPIs gibt es in vielen verschiedenen Formen und können basierend auf den Arten von Interaktionen kategorisiert werden, die sie bilden. Eine solche Kategorisierung ist homooligomer oder heterooligomer, je nach, ob die Wechselwirkungen zwischen identischen Untereinheiten oder verschiedenen Proteinen, die als Untereinheiten wirken, bestehen. Eine weitere Kategorisierung basiert auf der Stärke der Wechselwirkung, wenn die Wechselwirkungen zur Bildung stabiler Komplexe oder transienter komplexer Zustände führen. Strukturelle Informationen über die PPI zwischen Proteinen sind entscheidend für das Verständnis des Mechanismus, mit dem Proteine ihre Funktion erfüllen. Es wurde geschätzt, dass über 80% der Proteine auf komplexe Bildung angewiesen sind, um ihre funktionellen Rollen durchzuführen1. Angesichts des Prozentsatzes der Proteine, die für eine ordnungsgemäße angeborene Funktion auf PPI angewiesen sind, ist ihre Bedeutung in der Biologie leicht erkennbar, aber die Fähigkeit, die Proteine, die an diesen Wechselwirkungen teilnehmen, richtig untersuchen zu können, ist aufgrund der Beschränkungen der Techniken, die zur experimentellen Beobachtung zur Verfügung stehen, um zu beobachten, wann Proteine PPI bilden, eine Herausforderung geblieben.
Es gibt ein hohes Maß an Uneinigkeit zwischen den Ergebnissen für viele experimentell ermittelte PPI aufgrund der hohen Menge an Rauschen, falsch positive und falsche Negative, die von vielen der derzeit verfügbaren PPI-Bestimmungstechniken abgeleitet werden. Dies gilt insbesondere für das Hefe-Zwei-Hybrid-System (Y2H), die Tandem-Affinitätsreinigungs-Massenspektrometrie (TAP-MS) und die Fluoreszenzresonanz-Energieübertragung (FRET), die drei der am häufigsten verwendeten Methoden zur PPI-Bestimmung2,3,4,5,6,7darstellen. Im Vergleich dazu können proteinstrukturbiologische Techniken wie Kernspinresonanz (NMR), Röntgenkristallographie und Elektronenmikroskopie (EM) verwendet werden, um hochauflösende Strukturinformationen über Protein-Protein-Wechselwirkungen bis auf atomare Ebene zu gewinnen und eine direkte visuelle Bestätigung der Wechselwirkungen zu ermöglichen, die für ein Zielprotein von Interesse auftreten. Alle derzeit verfügbaren nicht-strukturbasierten PPI-bestimmenden Forschungstechniken (z. B. Y2H, TAP-MS und FRET) haben diese Fähigkeit und leiden zusätzlich unter Schwierigkeiten bei der Identifizierung schwacher und vorübergehender Wechselwirkungen zwischen Proteinen5. Diese Unzulänglichkeiten werden bei der Untersuchung von Membranproteinen aufgrund der zusätzlichen Komplexität, die durch die zusätzliche Variable der Lipidumgebung, die die Bildung einer richtigen quaternären Struktur und heteromeren komplexen Montage beeinflusst, noch verstärkt.
Membranproteine machen einen großen Teil des Proteoms aus und sind dafür bekannt, viele entscheidende Rollen bei der ordnungsgemäßen Zellfunktion in allen lebenden Organismen zu spielen. Trotz der Tatsache, dass Membranproteine schätzungsweise 27 % des menschlichen Genoms ausmachen und 60 % aller aktuellen Wirkstoffziele ausmachen, gibt es eine große Anomalie in der Anzahl der gelösten Modelle für Membranproteine, die nur 2,2 % aller veröffentlichten Proteinstrukturenausmachen 8,9,10. Die Hauptursache für die Diskrepanz bei der Verfügbarkeit von Strukturinformationen liegt in den intrinsischen Eigenschaften von Membranproteinen selbst. Aufgrund ihrer schlechten Löslichkeit, der Abhängigkeit von Wechselwirkungen mit einer Lipidumgebung zur Aufrechterhaltung der einheimischen Struktur und Funktion und der verschiedenen physikalisch-chemischen Eigenschaften der Lipidmembran selbst stellen Membranproteine weiterhin ein wesentliches Problem bei der Implementierung strukturbiologischer Techniken zur Untersuchung dar. Von diesen intrinsischen Eigenschaften ist die wichtigste für die Beschaffung genauer struktureller Informationen die Anforderung, Wechselwirkungen mit ihrer natürlichen Lipidumgebung zu haben, damit sie ihre native Struktur und Funktion erhalten. Die Lipidumgebung ist ein so integraler Bestandteil der Struktur und Funktion von Membranproteinen, dass das Konzept von Memtein (eine Kombination der Wörter Membran und Protein) als grundlegende Einheit der Membran-Protein-Struktur und Funktion vorgeschlagen wurde11. Trotz der Bedeutung von Lipid-Protein-Wechselwirkungen erfordern die derzeit verfügbaren strukturbasierten PPI-Bestimmungstechniken oft, dass die untersuchten Proteine löslich sind oder mit Reinigungsmitteln löslich sind. Die Exposition gegenüber harten Waschmitteln kann die Proteine denaturiert oder falsche Positiv- und Negative aufgrund von Delipidation verursachen, die Aggregation, Denaturierung von Protein, Dissoziation nicht-kovalenter Wechselwirkungen und Bildung künstlicher oligomerer Zustände induzieren können. Aufgrund der Notwendigkeit, eine natürliche Lipidumgebung für die genaue Bestimmung des nativen oligomeren Zustands von Membranproteinen zu erhalten, haben wir ein Native Cell Membrane Nanoparticles System (NCMNs)12 auf Basis der zuvor berichteten Styrol Maleic Acid Lipid Particles (SMALP)13 Methode entwickelt.
SMALP verwendet Styrol-Maleinsäure-Copolymer als membranaktives Polymer, um Membranproteine zu extrahieren und zu löslich. Poly (Styrene-Co-Maleic Acid) (SMA) ist ein einzigartiges amphiphiles Polymer aufgrund seiner hydrophoben Styrol-Moiety und diametral entgegengesetzten hydrophilen Maleinsäure-Moiety. Es bildet Nanopartikel, indem es in einem pH-abhängigen Mechanismus14adsorbiert, destabilisiert und die Zellmembran stört. Diese funktionelle Aktivität von SMA ermöglicht es, als waschmittelfreies System für membranproteinextraktion und Löslichkeit verwendet werden. Das NCMN-System unterscheidet sich in mehreren Aspekten vom SMALP-System. Das einzigartigste Merkmal des NCMN-Systems ist, dass es eine membranaktive Polymerbibliothek mit einer Vielzahl von Polymeren hat, die einzigartige Eigenschaften haben, die sie für die Isolierung vieler verschiedener Membranproteine geeignet machen, die unterschiedliche Bedingungen für Stabilität und native Funktion erfordern. Das NCMN-System hat auch andere Protokolle im Vergleich zur SMALP-Methode, wenn es um die Herstellung der Nanopartikel geht. Ein beispiel dafür ist, dass NCMNs eine einstufige Nickelaffinitätssäulenreinigung für die hochauflösende Strukturbestimmung verwenden. die Wirkung dieser verschiedenen Protokolle kann beim Vergleich des NCMNs-Protokolls, das 3,2 und 3,0 -C-Cryo-EM-AcrB-Strukturen erzeugte, mit einer ähnlichen Studie mit der SMALP-Methode beobachtet werden, die zu einer Kryo-EM-AcrB-Struktur mit einer Auflösung von 8,8 °12,15führte. Diese einzigartigen Merkmale des NCMN-Systems sind die Verbesserungen an der zuvor etablierten SMALP-Methode und machen es zu einem idealen Kandidaten für die Untersuchung von PPI.
Der Multidrug Efflux Transporter AcrB existiert als funktioneller Homotrimer in E. coli12. Eine mutagene Analyse ergab, dass eine einzelne P223G-Punktmutation, die sich auf einer Schleife befindet, die für die Stabilität des AcrB-Trimmers verantwortlich ist, den Trimmerzustand destabilisiert und bei der Herstellung mit dem Waschmittel DDM ein AcrB-Monomer ergibt, das mit nativer Blaugelelektrophorese16nachgewiesen werden konnte. Die FRET-Analyse des AcrB-P223G-Mutanten ergab jedoch, dass in der nativen Zellmembran-Lipid-Bilayer-Umgebung die Mehrheit der mutierten AcrB-P223G noch als Trimmer existierte und dass die Expressionswerte für den Wildtyp AcrB und AcrB-P223G ähnlich sind. Doch trotz der ERGEBNISSE der FRET-Analyse zeigte ein Aktivitätstest für den mutierten Transporter, dass die Aktivität im Vergleich zum Wildtyp16dramatisch zurückging. Obwohl die FRET-Technologie im Volksmund für die Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen verwendet wurde, hat die Forschung gezeigt, dass sie häufig falsch positive Ergebnisse geben kann17,18,19,20.
Kürzlich wurden hochauflösende Kryo-EM-Strukturen des AcrB-Trimers bestimmt, die die Wechselwirkung von AcrB mit der zugehörigen nativen Zellmembran Lipid-Bilayer durch den Einsatz der NCMNs12zeigten. Grundsätzlich können die NCMNs problemlos für die Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen auf der nativen Zellmembran verwendet werden. In einem Test dieses Systems wurden Experimente durchgeführt, um den oligomeren Zustand von AcrB-P223G mit nativen Zellmembran-Nanopartikeln und negativer Färbeelektronenmikroskopie direkt zu beobachten. Um mit den wilden AcrB-Nanopartikeln zu vergleichen, verwendeten wir das gleiche membranaktive Polymer (SMA2000 made in our laboratory, which is indexed as NCMNP1-1 in the NCMN library), das für die hochauflösende Kryo-EM-Strukturbestimmung von AcrB und alternativen Polymeren verwendet wird, die in der NCMNs-Bibliothek gefunden werden12. Basierend auf den zuvor berichteten Ergebnissen wurde erwartet, dass die Mehrheit der AcrB-P223G-Mutation in Form von trimernativen Zellmembran-Nanopartikeln21existieren würde. Es wurden jedoch keine AcrB-Trimmer in der Stichprobe gefunden, wie z. B. diejenigen, die mit dem wilden Typ AcrB beobachtet wurden. Dies deutet darauf hin, dass die Mehrheit der AcrB-P223G nicht Trimmer auf der nativen Zellmembran bildet, wie zuvor vorgeschlagen.
Hier berichten wir über eine detaillierte Analyse des mutierten E. coli AcrB-P223G im Vergleich mit dem Wildtyp E. coli AcrB mit den NCMNs. Diese Fallstudie von AcrB legt nahe, dass NCMNs ein gutes System für die Protein-Protein-Interaktionsanalyse ist.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30% Acrylamide/BIS SOL (37.5:1)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0158</td><td></td></tr><tr><td>4x Laemmli Sample Buffer (Loading Buffer)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid Glacial</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A38S-212</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Persulfate (APS)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Goldbio</td><td>C-105-5</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250 protein stain powder</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0400</td><td></td></tr><tr><td>DTT (Dithiothreitol) (&gt; 99% pure) Protease free</td><td>Goldbio</td><td>DTT10</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Affymetrix</td><td>17525 1 KG</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Goldbio</td><td>I2481C100</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Goldbio</td><td>K-120-25</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AA3622636</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimethylethylenediamine (EDTA)</td><td>Merck</td><td>8.03779.0100</td><td></td></tr><tr><td>NCMNS-P5-2</td><td>Not commercially available yet</td><td>Submit request for obtaining to corresponding author</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color Standard</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>SMA2000</td><td>Cray Valley</td><td>Submit request for obtaining to corresponding author</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>TCEP-HCl</td><td>Goldbio</td><td>TCEP25</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>Terrific Broth Media</td><td>Affymetrix</td><td>75856 1 KG</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0719</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl Acetate</td><td>Ambinter</td><td>Amb22348393</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-26S XPI</td><td>Beckman Coulter</td><td>B14538</td><td></td></tr><tr><td>Avanti JXN-30</td><td>Beckman Coulter</td><td>B34193</td><td></td></tr><tr><td>Carbon Electron Microscope Grids (10 nm)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>CF300-Cu-TH</td><td></td></tr><tr><td>Con-Torque Tissue Homogenizer</td><td>Eberbach</td><td>E7265</td><td></td></tr><tr><td>Corning LSE Mini Microcentrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>07-203-954</td><td></td></tr><tr><td>EmulsiFlex-C3</td><td>Avestin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fraction Collector F9-R</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>29003875</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>165-8004</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 Spectrophotometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-90K Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN LL-IM-12AB</td><td></td></tr><tr><td>PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System</td><td>Ted Pella</td><td>91000S-230</td><td></td></tr><tr><td>Potter-Elvehjem Safe Grind Tissue Grinder</td><td>Wheaton</td><td>358013</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Basic Power Supply</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>Razel R99-E Variable Speed Syringe Pump</td><td>Razel Scientific Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>Tecnai F20 200kV</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Type 70 Ti Fixed-Angle Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;General Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Microcentrifuge Tubes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>4 ml Amicon Ultra-4 30 kDa</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC803024</td><td></td></tr><tr><td>AKTA pure 25 L1 FPLC</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>29018225</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3)pLysS Cells</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C606003</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tube</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>HisTrap HP 5 ml Column</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17524802</td><td></td></tr><tr><td>pET-24a</td><td>EMD Biosciences</td><td>69749-3</td><td></td></tr></tbody></table>

native cell membrane nanoparticles system for membrane protein-protein interaction analysis

Protein-Protein-Wechselwirkungen in Zellmembransystemen spielen eine entscheidende Rolle in einer Vielzahl biologischer Prozesse - von Zell-zu-Zell-Interaktionen bis hin zur Signaltransduktion; von der Erfassung von Umweltsignalen bis hin zur biologischen Reaktion; von der metabolischen Regulierung bis zur Entwicklungskontrolle. Genaue strukturelle Informationen über Protein-Protein-Wechselwirkungen sind entscheidend für das Verständnis der molekularen Mechanismen von Membranproteinkomplexen und für die Entwicklung hochspezifischer Moleküle zur Modulation dieser Proteine. Für den Nachweis und die Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen wurden zahlreiche In-vivo- und In-vitro-Ansätze entwickelt. Unter ihnen ist der strukturbiologische Ansatz insofern einzigartig, als er direkte strukturelle Informationen über Protein-Protein-Wechselwirkungen auf atomarer Ebene liefern kann. Die derzeitige Membranproteinstrukturbiologie beschränkt sich jedoch noch weitgehend auf Waschmittel-basierte Methoden. Der Hauptnachteil von Waschmittel-basierten Methoden ist, dass sie oft Membranproteinkomplexe dissoziieren oder denaturieren, sobald ihre native Lipid-Doppelschichtumgebung durch Waschmittelmoleküle entfernt wird. Wir haben ein natives Zellmembran-Nanopartikelsystem für die Strukturbiologie von Membranproteinen entwickelt. Hier zeigen wir den Einsatz dieses Systems bei der Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen auf der Zellmembran mit einer Fallstudie des oligomeren Zustands von AcrB.

Mit den hier vorgestellten Verfahren wurden Proben des Wildtyps E. coli AcrB und des E. coli-Mutanten AcrB-P223G gereinigt. Die Proben wurden dann auf kohlenstoffnegative Fleckenelektronenmikroskopiegitter adsorbiert und mit Uranylacetat mit der Side Blotting Methode22gebeizt. Negative Fleckenbilder wurden mittels Transmissionselektronenmikroskopie gesammelt. Das negative Fleckenbild für die mit DDM gereinigte AcrB-Wild-Musterprobe zeigt eine homogene Lösung monodisperser Parti...

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Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Hier wird ein Protokoll zur Bestimmung des oligomeren Zustands von Membranproteinen vorgestellt, das ein natives Zellmembran-Nanopartikelsystem in Verbindung mit der Elektronenmikroskopie nutzt.

Native Cell Membrane Nanoparticles System für Membran-Protein-Protein-Interaktionsanalyse

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

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Biochemistry

5.9K Aufrufe.  Virginia Commonwealth University. Hier wird ein Protokoll zur Bestimmung des oligomeren Zustands von Membranproteinen vorgestellt, das ein natives Zellmembran-Nanopartikelsystem in Verbindung mit der Elektronenmikroskopie nutzt.

Serie: Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Forschung

Biochemie

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

Verfahren zum Visualisieren und Analysieren Membran interagierender Proteine ​​durch Transmissionselektronenmikroskopie

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores

Solid-state nanopores have been used to perform measurements at the single-molecule level to examine the local structure and flexibility of nucleic acids 1-6, the unfolding of proteins 7, and binding affinity of different ligands 8. By coupling these nanopores to the resistive-pulse technique 9-12, such measurements can be done under a wide variety of conditions and without the need for labeling 3. In the resistive-pulse technique, an ionic salt solution is introduced on both sides of the nanopore. Therefore, ions are driven from one side of the chamber to the other by an applied transmembrane potential, resulting in a steady current. The partitioning of an analyte into the nanopore causes a well-defined deflection in this current, which can be analyzed to extract single-molecule information. Using this technique, the adsorption of single proteins to the nanopore walls can be monitored under a wide range of conditions 13. Protein adsorption is growing in importance, because as microfluidic devices shrink in size, the interaction of these systems with single proteins becomes a concern. This protocol describes a rapid assay for protein binding to nitride films, which can readily be extended to other thin films amenable to nanopore drilling, or to functionalized nitride surfaces. A variety of proteins may be explored under a wide range of solutions and denaturing conditions. Additionally, this protocol may be used to explore more basic problems using nanopore spectroscopy.

A method of using solid-state nanopores to monitor the non-specific adsorption of proteins onto an inorganic surface is described. The method employs the resistive-pulse principle, allowing for the adsorption to be probed in real-time and at the single-molecule level. Because the process of single protein adsorption is far from equilibrium, we propose the employment of parallel arrays of synthetic nanopores, enabling for the quantitative determination of the apparent first-order reaction rate constant of protein adsorption as well as and the Langmuir adsorption constant.

Überwachung Proteinadsorption mit Solid-State-Nanoporen

Solid-state nanopores have been used to perform measurements at the single-molecule level to examine the local structure and flexibility of nucleic acids ...

Biotechnik

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The modification presented includes the combination of this technique with cell-penetrating sequences. We propose to design cell-penetrating baits that can be incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions found will reflect those that occur within the intracellular context. Connexin43 (Cx43), a protein that forms gap junction channels and hemichannels is down-regulated in high-grade gliomas. The Cx43 region comprising amino acids 266-283 is responsible for the inhibition of the oncogenic activity of c-Src in glioma cells. Here we use TAT as the cell-penetrating sequence, biotin as the pull-down tag and the region of Cx43 comprised between amino acids 266-283 as the target to find intracellular interactions in the hard-to-transfect human glioma stem cells. One of the limitations of the proposed method is that the molecule used as bait could fail to fold properly and, consequently, the interactions found could not be associated with the effect. However, this method can be especially interesting for the interactions involved in signal transduction pathways because they are usually carried out by intrinsically disordered regions and, therefore, they do not require an ordered folding. In addition, one of the advantages of the proposed method is that the relevance of each residue on the interaction can be easily studied. This is a modular system; therefore, other cell-penetrating sequences, other tags, and other intracellular targets can be employed. Finally, the scope of this protocol is far beyond protein-protein interaction because this system can be applied to other bioactive cargoes such as RNA sequences, nanoparticles, viruses or any molecule that can be transduced with cell-penetrating sequences and fused to pull-down tags to study their intracellular mechanism of action.

This is a protocol to study intracellular protein-protein interactions based on the biotin-avidin pull-down system with the novelty of combining cell-penetrating sequences. The main advantage is that the target sequence is incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions will occur within the cellular context.

Biotinylierte Zelle eindringen Peptide, intrazelluläre Protein-Protein-Wechselwirkungen zu studieren

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to identify and characterize their interactions are necessary5. To this end, we developed the Membrane Strep-protein interaction experiment, called Membrane-SPINE6. This technique combines in vivo cross-linking using the reversible cross-linker formaldehyde with affinity purification of a Strep-tagged membrane bait protein. During the procedure, cross-linked prey proteins are co-purified with the membrane bait protein and subsequently separated by boiling. Hence, two major tasks can be executed when analyzing protein-protein interactions (PPIs) of membrane proteins using Membrane-SPINE: first, the confirmation of a proposed interaction partner by immunoblotting, and second, the identification of new interaction partners by mass spectrometry analysis. Moreover, even low affinity, transient PPIs are detectable by this technique. Finally, Membrane-SPINE is adaptable to almost any cell type, making it applicable as a powerful screening tool to identify PPIs of membrane proteins.

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

A biochemical approach is described to identify in vivo protein-protein interactions (PPI) of membrane proteins. The method combines protein cross-linking, affinity purification and mass spectrometry, and is adaptable to almost any cell type or organism. With this approach, even the identification of transient PPIs becomes possible.

Membran-DORN: Ein Tool, um biochemische Protein-Protein-Interaktionen von Membranproteinen Identifizieren<em&gt; In Vivo</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions largely depend on intracellular protein&#8211;protein interactions. Therefore, research regarding these interactions is indispensable to facilitating the understanding of physiologic processes. Co-precipitation of associated proteins, followed by mass spectrometry (MS) analysis, enables the identification of novel protein interactions. In this study, we have provided details of the novel technique of immunoprecipitation-liquid chromatography (LC)-MS/MS analysis combined with on-membrane digestion for the analysis of protein&#8211;protein interactions. This technique is suitable for crude immunoprecipitants and can improve the throughput of proteomic analyses. Tagged recombinant proteins were precipitated using specific antibodies; next, immunoprecipitants blotted onto polyvinylidene difluoride membrane pieces were subjected to reductive alkylation. Following trypsinization, the digested protein residues were analyzed using LC-MS/MS. Using this technique, we were able to identify several candidate associated proteins. Thus, this method is convenient and useful for the characterization of novel protein&#8211;protein interactions.

Here, we present a protocol for an on-membrane digestion technique for the preparation of samples for mass spectrometry. This technique facilitates the convenient analysis of protein&#8211;protein interactions.

Bewertung von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit einer On-Membrane-Verdauungstechnik

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug discovery because they are the targets of more than half of all drugs. An obstacle to conducting biochemical, biophysical, and structural studies of membrane proteins as well as antibody development has been the difficulty in producing large amounts of high-quality membrane protein with correct conformation and activity. Here we describe a &#8220;bilayer-dialysis method&#8221; using a wheat germ cell-free system, liposomes, and dialysis cups to efficiently synthesize membrane proteins and prepare purified proteoliposomes in a short time with a high success rate. Membrane proteins can be produced as much as in several milligrams, such as GPCRs, ion channels, transporters, and tetraspanins. This cell-free method contributes to reducing the time, cost and effort for preparing high-quality proteoliposomes, and provides suitable means for functional analysis of membrane proteins, drug targets screening, and antibody development.

This protocol describes an efficient cell-free method for production of high-quality proteoliposome by bilayer-dialysis method using wheat cell-free system and liposomes. This method provides suitable means for functional analysis of membrane proteins, drug targets screening, and antibody development.

Zellfreie Produktion von Proteoliposomen für die funktionelle Analyse und Antikörperentwicklung gegen Membranproteine

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological studies. In the past years, it has become increasingly clear that living cells respond, not only to the biochemical nature of the molecules presented to them but also to the way these molecules are presented. Creating protein micro-patterns is therefore now standard in many biology laboratories; nano-patterns are also more accessible. However, in the context of cell-cell interactions, there is a need to pattern not only proteins but also lipid bilayers. Such dual proteo-lipidic patterning has so far not been easily accessible. We offer a facile technique to create protein nano-dots supported on glass and propose a method to backfill the inter-dot space with a supported lipid bilayer (SLB). From photo-bleaching of tracer fluorescent lipids included in the SLB, we demonstrate that the bilayer exhibits considerable in-plane fluidity. Functionalizing the protein dots with fluorescent groups allows us to image them and to show that they are ordered in a regular hexagonal lattice. The typical dot size is about 800 nm and the spacing demonstrated here is 2 microns. These substrates are expected to serve as useful platforms for cell adhesion, migration and mechano-sensing studies.

We present a protocol to functionalize glass with nanometric protein patches surrounded by a fluid lipid bilayer. These substrates are compatible with advanced optical microscopy and are expected to serve as platform for cell adhesion and migration studies.

Ligand Nano-Cluster-Arrays in einem unterstützten Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level. There are several methods, both in vitro and in vivo, to evaluate protein binding, and at least two methods that complement the shortcomings of each other should be conducted to obtain reliable insights. 
For an in vivo assay, the bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay represents the most popular and least invasive approach that enables to detect protein-protein interaction within living cells, as well as identify the intracellular localization of the interacting proteins 1,2. In this assay, non-fluorescent N- and C-terminal halves of GFP or its variants are fused to tested proteins, and when the two fusion proteins are brought together due to the tested proteins&#x2019; interactions, the fluorescent signal is reconstituted3-6. Because its signal is readily detectable by epifluorescence or confocal microscopy, BiFC has emerged as a powerful tool of choice among cell biologists for studying about protein-protein interactions in living cells 3. This assay, however, can sometimes produce false positive results. For example, the fluorescent signal can be reconstituted by two GFP fragments arranged as far as 7 nm from each other due to close packing in a small subcellular compartment, rather that due to specific interactions7.
Due to these limitations, the results obtained from live cell imaging technologies should be confirmed by an independent approach based on a different principle for detecting protein interactions. Co-immunoprecipitation (Co-IP) or glutathione transferase (GST) pull-down assays represent such alternative methods that are commonly used to analyze protein-protein interactions in vitro. However, iIn these assays, however, the tested proteins must be readily soluble in the buffer that supportsused for the binding reaction. Therefore, specific interactions involving an insoluble protein cannot be assessed by these techniques.
 Here, we illustrate the protocol for the protein membrane overlay binding assay, which circumvents this difficulty. In this technique, interaction between soluble and insoluble proteins can be reliably tested because one of the proteins is immobilized on a membrane matrix. This method, in combination with in vivo experiments, such as BiFC, provides a reliable approach to investigate and characterize interactions faithfully between soluble and insoluble proteins. In this article, binding between Tobacco mosaic virus (TMV) movement protein (MP), which exerts multiple functions during viral cell-to-cell transport8-14, and a recently identified plant cellular interactor, tobacco ankyrin repeat-containing protein (ANK) 15, is demonstrated using this technique.

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Testing protein-protein interaction is indispensable for dissection of protein functionality. Here, we introduce an in vitro protein-protein binding assay to probe a membrane-immobilized protein with a soluble protein. This assay provides a reliable method to test interaction between an insoluble protein and a protein in solution.

Proteinmembran Overlay Assay: Ein Protokoll, die Interaktion zwischen löslichen und unlöslichen Proteinen testen In-vitro-</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Biologie

Membrane Transport Processes Analyzed by a Highly Parallel Nanopore Chip System at Single Protein Resolution

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable efforts have been made in this field, but techniques enabling automated high-throughput transport analysis in combination with solvent-free lipid bilayer techniques required for the analysis of membrane transporters are rare. This class of transporters however is crucial in cell homeostasis and therefore a key target in drug development and methodologies to gain new insights desperately needed.
The here presented manuscript describes the establishment and handling of a novel biochip for the analysis of membrane protein mediated transport processes at single transporter resolution. The biochip is composed of microcavities enclosed by nanopores that is highly parallel in its design and can be produced in industrial grade and quantity. Protein-harboring liposomes can directly be applied to the chip surface forming self-assembled pore-spanning lipid bilayers using SSM-techniques (solid supported lipid membranes). Pore-spanning parts of the membrane are freestanding, providing the interface for substrate translocation into or out of the cavity space, which can be followed by multi-spectral fluorescent readout in real-time. The establishment of standard operating procedures (SOPs) allows the straightforward establishment of protein-harboring lipid bilayers on the chip surface of virtually every membrane protein that can be reconstituted functionally. The sole prerequisite is the establishment of a fluorescent read-out system for non-electrogenic transport substrates.
High-content screening applications are accomplishable by the use of automated inverted fluorescent microscopes recording multiple chips in parallel. Large data sets can be analyzed using the freely available custom-designed analysis software. Three-color multi spectral fluorescent read-out furthermore allows for unbiased data discrimination into different event classes, eliminating false positive results.
The chip technology is currently based on SiO2 surfaces, but further functionalization using gold-coated chip surfaces is also possible.

The presented protocol describes the analysis of membrane protein mediated transport on the single transporter level using pore-spanning solvent-free lipid bilayers. This is achieved by the creation of bulk produced nanopore array chips, combined with highly parallel data acquisition and analysis, enabling the future establishment of membrane protein effector screenings.

Membrantransportprozesse durch eine hochparallele Nanopore Chip-System bei Einzel Protein Resolution Analysierte

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System für Membran-Protein-Protein-Interaktionsanalyse

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen

Verfahren zum Visualisieren und Analysieren Membran interagierender Proteine durch Transmissionselektronenmikroskopie

Überwachung Proteinadsorption mit Solid-State-Nanoporen

Biotinylierte Zelle eindringen Peptide, intrazelluläre Protein-Protein-Wechselwirkungen zu studieren

Membran-DORN: Ein Tool, um biochemische Protein-Protein-Interaktionen von Membranproteinen Identifizieren

Bewertung von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit einer On-Membrane-Verdauungstechnik

Zellfreie Produktion von Proteoliposomen für die funktionelle Analyse und Antikörperentwicklung gegen Membranproteine

Ligand Nano-Cluster-Arrays in einem unterstützten Lipid Bilayer

Proteinmembran Overlay Assay: Ein Protokoll, die Interaktion zwischen löslichen und unlöslichen Proteinen testen In-vitro-

Membrantransportprozesse durch eine hochparallele Nanopore Chip-System bei Einzel Protein Resolution Analysierte

Native Cell Membrane Nanoparticles System für Membran-Protein-Protein-Interaktionsanalyse

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Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen

Verfahren zum Visualisieren und Analysieren Membran interagierender Proteine ​​durch Transmissionselektronenmikroskopie

Überwachung Proteinadsorption mit Solid-State-Nanoporen

Biotinylierte Zelle eindringen Peptide, intrazelluläre Protein-Protein-Wechselwirkungen zu studieren

Membran-DORN: Ein Tool, um biochemische Protein-Protein-Interaktionen von Membranproteinen Identifizieren

Bewertung von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit einer On-Membrane-Verdauungstechnik

Zellfreie Produktion von Proteoliposomen für die funktionelle Analyse und Antikörperentwicklung gegen Membranproteine

Ligand Nano-Cluster-Arrays in einem unterstützten Lipid Bilayer

Proteinmembran Overlay Assay: Ein Protokoll, die Interaktion zwischen löslichen und unlöslichen Proteinen testen In-vitro-

Membrantransportprozesse durch eine hochparallele Nanopore Chip-System bei Einzel Protein Resolution Analysierte

Verfahren zum Visualisieren und Analysieren Membran interagierender Proteine durch Transmissionselektronenmikroskopie