In diesem Protokoll beschreiben wir eine einfache Methode zur Herstellung eines papierbasierten Geräts namens XO Pad, das für die effektive Anreicherung in Isolation von extrazellulären Vesikeln entwickelt wurde. Das XO Pad ist ein einfaches Gerät, das extrazelluläre Vesikel ohne den Einsatz von Chemikalien oder Arbeitsmaschinen vorkonzentrieren und isolieren kann, während es höhere Rückgewinnungsraten als herkömmliche Methoden zeigt. Definieren Sie zunächst den Bereich, der mit Druckersoftware gedruckt werden soll.
Das Design sollte 12 wachsgemusterte Schichten haben, in denen sich die Durchmesser der kreisförmigen Probenbereiche allmählich von fünf auf zwei Millimeter verengen. Drucken Sie dann hydrophobes Wachs auf die ausgewiesenen Bereiche auf beiden Seiten des Zellulosepapiers. Legen Sie das wachsbedruckte Papier für 80 Sekunden bei 120 Grad Celsius in einen Laborofen und schneiden Sie dann das Wachsgedruckte Papier mit einem Fräser, um einzelne XO Pad-Geräte herzustellen.
Lassen Sie eine selektive Permmembran mit fünf und zwei Mikrolitern auf die Probenbereiche in den links- bzw. rechten Schichten fallen. Legen Sie die mit der perm selektiven Membran kodierenden Schichten 30 Minuten lang bei 70 Grad Celsius auf einer Kochplatte, um das Lösungsmittel zu verdampfen. Versiegeln Sie dann die äußerste Oberfläche der beschichteten Schicht mit Blick auf die Pufferlösung mit druckempfindlichem Klebeband und hinterlassen Sie ein kleines Loch.
Falten Sie das XO Pad Gerät entlang der weißen Linien hin und her, um alle Probenbereiche konvergieren danieren danieren zu können. 15 Mikroliter der Mikrovesikund- und Exosomenprobe in den konvergenten Probenbereichen pipette und einige Sekunden warten, um eine vollständige Benetzung zu gewährleisten. Legen Sie zwei Acrylkammern an beiden Enden des XO Pads und klemmen Sie es sicher mit kleinen Bindemittelclips, um eine Entfaltung zu verhindern.
Füllen Sie die Kammern mit 110 Mikroliter0,1X PBS und setzen Sie zwei Silberelektroden ein. Verwenden Sie dann ein Stromspannungsquellenmesssystem, um 30 Volt für 20 Minuten auf die Elektroden aufzutragen. Um die angereicherten Mikrovesiken und Exosomen zu isolieren, trennen Sie das gefaltete XO Pad von den Acrylkammern und entfalten Sie das Gerät, um die angereicherten Partikel von den anderen Schichten zu isolieren.
Punch out die Probenbereiche in den Schichten acht und neun, wo die Mikrovesiken und Exosomen für die nachgelagerte Analyse angereichert werden. Um die Betriebszeit für eine maximale Rückgewinnung der angereicherten Partikel zu optimieren, wurde ein Zeitraffer-Migrationstest von fluoreszierend markierten Mikrovesikeln und Exosomen durchgeführt. Die Fluoreszenzintensitäten in allen Probenbereichen wurden mit der ImageJ-Software quantifiziert.
Vor dem Anreicherungsprozess wurden Mikrovesiken und Exosomen in allen Probenbereichen mit einer allmählichen Abnahme der Intensität dispergiert. Nach 10 Minuten Verarbeitung migrierten die Partikel elektrokinetisch und ein sofortiger Vorkonzentrationsstecker erschien auf Schicht sieben. Als die Zeit 20 Minuten erreichte, konzentrierten sich Mikrovesiken und Exosomen stark auf die Schichten acht und neun und wurden auf der Grundlage der Fluoreszenzintensitäten um das Fünffache angereichert.
Die Integrität der angereicherten Mikrovesikle und Exosomen in Schicht 8 wurde mit SEM untersucht. Deutlich mehr nicht geschädigte Partikel wurden nach dem Anreicherungsprozess beobachtet. Die Größenverteilung der angereicherten Mikrovesiken und Exosomen wurde ebenfalls analysiert.
Anschließend wurde die tatsächliche Konzentration der angereicherten Mikrovesikeln und Exosomen auf den Probenbereichen in den Schichten sechs, acht und 10 analysiert. In Schicht acht wurden die Mikrovesiken und Exosomen um den Faktor 5,58 vorkonzentriert, in den anderen Schichten wurde jedoch keine spürbare Vorkonzentration beobachtet. Um die Reproduzierbarkeit dieses Verfahrens zu gewährleisten, befolgten Sie genau das Protokoll für Ofeninkubationszeit und -temperatur während der Geräteüberprüfung und Der Gerätebetriebszeit, da dies die optimierten Bedingungen sind.
Das XO Pad kann auch verwendet werden, um extrazelluläre Vesikel von proteinreichen Proben wie Serum oder Plasma zu trennen und zu isolieren, indem Carbonatpuffer verwendet werden. Dieses Protokoll kann ein effizientes, einfaches Vorbereitungswerkzeug mit seinen vorkonzentrierenden und isolierenden Fähigkeiten bieten, die für die klinische Forschung erforderlich sind, wie Diagnose, Arzneimittelabgabe, Immuntherapie und andere Therapeutika.
