Dieses Protokoll ermöglicht die Verfolgung und Quantifizierung des Abbaus eines Proteins von Interesse an lebenden und alternden C.elegans. Diese in vivo und nichtinvasive Technik erfordert nur wenig Mikroskopie eingerichtet, um Dendra2 zuverlässig in ein helles und stabiles Fluorophor umzuwandeln. Die Methode ist an Säugetiersysteme sowie Zebrafische anpassungsfähig.
Zu studieren, in Umsatz innerhalb des Proteostatis-Netzwerks sowie Transport und Menschenhandel setzen. Achten Sie darauf, keine unerwünschte Konvertierung von Dendra2 beim Scannen mit dem Blaulichtlaser zu provozieren und die Erfassungseinstellungen und Konvertierungseinstellungen für jedes System und Fusion-Protein zu testen und zu optimieren. Beginnen Sie mit dem Anbau altersgerechter Nematoden bei 20 Grad Celsius auf das gewünschte Alter für das Experiment.
Am Tag des bildgebenden Experiments entstand in einer Konzentration von 3% in doppelt destilliertem Wasser eine Schmelze-Allgemeinatrat-Agarose. Während die Agarose abkühlt, schneiden Sie die Spitze einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze, um die Aspiration von ca. 400 Mikrolitern der geschmolzenen Agarose zu erleichtern. Fügen Sie vorsichtig ein paar Tropfen Agarose auf eine saubere Glasrutsche und legen Sie sofort eine weitere Rutsche auf die Tropfen, um ein dünnes Pad Von-Agarose zwischen den beiden Glasstücken zu schaffen.
Wenn die Agarose getrocknet ist, entfernen Sie vorsichtig die obere Rutsche. Wenn genügend Dias vorbereitet wurden, öffnen Sie die konfokale Mikroskop-Software und stellen Sie den Lichtpfad für Anregung und Emission ein. Für grüne Dendra2 486 bis 553 Nanometer hinzufügen, und für rote Dendra2 fügen Sie 580 bis 740 Nanometer hinzu.
Stellen Sie die Leistung und Verstärkung beider Kanäle entsprechend der Intensität des Fluorophors ein und stellen Sie das Loch auf vollständig geöffnet ein. Wählen Sie einen sequenziellen Kanalmodus aus, und legen Sie die Spur so fest, dass sie jeden Frame wechselt. Legen Sie den Scanmodus als Rahmen und die Rahmengröße auf 1024 bis 1024 mit einem Linienschritt von 1 fest.
Legen Sie die Mittelung auf zwei und die mittlere Methode und den Modus der unidirektionalen Linie auf den Mittelwert fest. Stellen Sie die Bittiefe auf acht Bit fest. Definieren Sie die multidimensionale Erfassungseinstellung für die Konvertierung von Dendra2.
Verwenden Sie für die Umwandlung und Dasbleichung den 405 Nanometer Diodenlaser, der auf 60 % Energieleistung eingestellt ist. Wählen Sie eine Zeitreihe von zwei Zyklen mit einem Intervall von 0,0 Millisekunden zwischen den Zyklen und einem normalen Start und Stopp aus. Legen Sie die Bleichen nach dem Scannen einer von zwei zu starten, für 30 Iterationen zu wiederholen und zu stoppen, wenn die Intensität auf 50% sinkt Dann definieren Sie die Geschwindigkeit der Erfassung Pixel wohnen schnell für die Konvertierung und auf Medium für die Aufnahme eines Snap-Bild.
Um die Nematoden auf den Dias zu montieren, verwenden Sie einen permanenten Marker, um ein Fenster mit vier Quadraten auf der gegenüberliegenden Seite des Agarose-Pads auf jeder Folie zu zeichnen und zu nummerieren. Fügen Sie 15 Mikroliter Levamisol in die Mitte des Agarose-Pads und verwenden Sie ein Stereomikroskop und einen Drahtpick, um für altersgerechte Nematoden in das Tröpfchen zu übertragen. Verwenden Sie eine Wimpernauswahl, um jede Nematode sanft in ein Fenster des Quadrats zu bewegen.
Wenn alle Nematoden neu positioniert wurden, warten Sie, bis sich die Würmer nicht mehr bewegen, bevor Sie einen Deckelschlupf über die Flüssigkeit legen, um die Nematoden während der Bildgebung zu immobilisieren. Legen Sie dann die Folie auf die konfokale Mikroskopstufe. Für grüne Dendra2-Umwandlung verwenden Sie das Okular des 20 X Objektivs unter grüner Fluoreszenz, um die erste Nematode zu lokalisieren und sich auf den Kopf oder Schwanz zu konzentrieren.
Wechseln Sie in den konfokalen Modus und erhöhen oder verringern Sie die Verstärkung und Laserleistung, um ein gesättigtes, aber nicht überbelichtetes Bild zu erhalten. Zeichnen Sie eine Region von Interesse um das ausgewählte Neuron und ziehen Sie eine zweite größere Region von Interesse um den Schwanz, die die erste Region von Interesse enthält. Legen Sie die erste region fest, die erworben, gebleicht und analysiert werden soll.
Legen Sie den zweiten Bereich fest, der erworben und analysiert, aber nicht gebleicht werden soll. Stellen Sie die Scangeschwindigkeit auf maximum ein und starten Sie den Scan, um die ausgewählten Dendra2-Neuronen zu konvertieren. Unmittelbar nach der Konvertierung beginnen Sie mit dem Grünen 561 Nanometer Laser mit dem Live-Scannen, um Dendra2 im roten Kanal zu visualisieren und den Fokus und die jeweilige maximale Projektion des umgewandelten Neurons zu finden.
Stellen Sie die Scanrate schnell auf eine niedrigere Pixelverweilgeschwindigkeit ein und erfassen Sie ein Snapshot-Bild beider Kanäle mit einer höheren Auflösung. Dieses Bild wird nach der Konvertierung zum Zeitpunkt Null betrachtet. Speichern Sie dann den Scan mit einem identifizierbaren Namen und einer Nummer, gefolgt von der Bezeichnung "Zeit null".
Um den Dendra2-Abbau im Laufe der Zeit zu verfolgen, öffnen Sie das Mal Nullbild des jeweiligen Nematoden-Neurons. Mit der gleichen Bildeinstellung beginnen Sie live im roten Kanal zu scannen und das konvertierte rote Neuron in den Fokus zu rücken. Dann, ohne Erfassungsparameter zu ändern, erhalten Sie einen Snapshot mit der gleichen Geschwindigkeit wie das erste Bild.
Achten Sie darauf, Ihre Konvertierungseinstellung sorgfältig zu definieren, um Dendra2 effizient und ausreichend zu konvertieren und die gleichen Erfassungsparameter über verschiedene Zeitpunkte hinweg beizubehalten. Um die konvertierten Dendra2-Bilder zu analysieren, öffnen Sie die Zeit-Null- und zweiten Zeitpunktbilder in Fidschi und öffnen Sie "Messungen analysieren und festlegen". Wählen Sie die Funktionen Fläche und integrierte Dichte aus, und wählen Sie das Bild aus, das mit dem roten Kanal erhalten wurde.
Zeichnen Sie mit dem Polygonauswahlwerkzeug einen Interessenbereich um die Zeit Null konvertiertes Neuron. Um die Konturen des Neurons richtig zu identifizieren, wählen Sie Bild, Anpassen und Schwellenwert aus, um die Intensitätsschwellen hervorzuheben. Nachdem die Auswahl definiert wurde, klicken Sie auf Analysieren und Messen.
Es wird ein Popup-Ergebnisfenster angezeigt, das die Flächen-, integrierten Dichte- und integrierten Rohdichtewerte für den ausgewählten Interessenbereich einschließen wird. Führen Sie den gleichen Auswahl- und Messprozess für das Bild ab dem zweiten Zeitpunkt durch. Kopieren Sie dann die Werte in die Kalkulationstabelle.
In dieser repräsentativen Analyse vor der Konvertierung war kein rotes Signal sichtbar, wenn die Probe im roten Kanal angeregt wurde. Bei bestrahlung verringerte sich das grüne Signal, als HTT-D2 umgewandelt wurde und anschließend ein rotes Signal erschien. HTT-D2-Expression im Laufe der Zeit abgebaut, was zu einer Verringerung der Niveaus des roten HTT-D2-Signals und eine mögliche Erhöhung des grünen HTT-D2-Signals, da mehr Fusion Protein neu synthetisiert wurde.
Insbesondere wurden die Neuronen der Schwanzregion als signifikant aktiver im Vergleich zu denen des Kopfes bestimmt. Darüber hinaus gab es deutlich mehr Abbau der Kontrolle HTTQ25-D2 24 Stunden nach der Umwandlung, dann nach zwei Stunden in den Kopf und Schwanz Neuronen. Dieser Unterschied wurde bei pathogenen HTTQ97-D2 nicht beobachtet, was darauf hindeutet, dass das Proteostase-Netzwerk nicht in der Lage war, HTT-D2 zu entfernen, das längere Glutamin-Strecken im gesamten Nervensystem enthält.
HTTQ97-D2 wurde nicht so effizient abgebaut wie HTTQ25-D2 in sehr alten Nematoden, was die Unfähigkeit des Proteostase-Netzwerks unterstreicht, aggregierte und möglicherweise toxische Arten von Huntingtin bei älteren Tieren zu entfernen. Wichtig ist, Schwanz neuronen waren in der Lage, mit toxischen HTTQ97-D2 in jungen Nematoden zu bewältigen, was darauf hindeutet, dass verschiedene begleite Proteostase Netzwerkmechanismen am Werk sein könnte, um HTT-D2 zu entfernen. Für jede Probe erfassen und nicht überbelichtet und ungesättigte Bild unmittelbar nach der Konvertierung und wiederverwenden sie die gleiche Einstellung für diese Probe im Laufe der Zeit.
Mit diesem Protokoll ist es möglich, Veränderungen in einem Proteostatis-Netzwerk zu testen und mit Hilfe der superhochauflösenden Mikroskopie die Ausbreitung von krankheitsassoziierten Proteinen zu verfolgen.
